小鼠Lewis肺癌原位模型的建立

李宁，张晓晔，蒋中秀，刘洋，李雪娇

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004)

目前，在肺癌的动物实验中，大多使用小鼠皮下种植肺癌细胞系，在皮下形成肺癌肿瘤结节的动物模型，如孙秋艳等[1]用体外培养的Lewis细胞悬液注射于小鼠左侧腋下，形成皮下肿瘤；Xu等[2]应用A549肺癌细胞悬液加入等量的Matrigel中，注射至裸鼠的皮下组织亦可形成肿瘤模型。但是，这种肺癌模型小鼠出现的症状、并发症、一般状态及转移情况与临床患者的实际情况存在很大的差别。建立一种简便易行、经济、接近于人原发肺癌的动物模型，对肺癌体内研究的具有重要意义。本实验通过将Matrigel与Lewis制备细胞混悬液注射于小鼠左肺内，建立小鼠Lewis肺癌原位模型，具有经济、简便、快速成瘤等优点，而且所建立的肺癌原位模型更接近于人类肺癌自然过程，具有更好的研究利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

小鼠Lewis肺癌细胞株(中科院上海细胞库，中国)、10%胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%胰酶(均为Hyclone公司产品，美国)、Matrigel(BD公司，美国)、细胞培养箱、超净台、电子称等均由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。

1.1.2 实验动物

SPF级C57BL/6纯系小鼠，6～8周龄，雄性，体重19 ～21 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京) 2009-0004】，在中国医科大学附属盛京医院实验动物中心实验室无特定病原体(specific pathogen free，SPF)的饲养间饲养和进行无菌手术【SYXK(辽) 2010-0008】。所有实验操作程序均经过中国医科大学附属盛京医院实验动物中心批准，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理

将小鼠Lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及高糖DMEM的完全培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每1～2d更换培养液1次，每3 d用0.25%胰酶消化传代一次。细胞汇合率达90%时(如图2)，收集细胞，离心去上清，加入PBS吹打，使细胞悬浮于PBS中，台盼蓝染色细胞活力测定大于95%，并进行细胞计数，调整细胞浓度为4×107/mL的细胞悬液备用。

1.2.2 注射前Matrigel的准备

Matrigel置于-20℃长期保存，用时将其置于冰浴放入4℃冰箱中过夜融化，将已融化的Matrigel和4×107/mL浓度的细胞悬液按1∶1混匀，这一操作在冰浴中进行。

1.2.3 原位肺癌动物模型的建立

①分组：小鼠共30只，其中25只用于观察肿瘤的生长情况，分别在术后的第4、7、10、13、16天各处死小鼠5只，另外5只用于生存曲线的测定。②麻醉：水合氯醛溶液10 mg/mL，按0.05 mL/10 g体重剂量对小鼠进行麻醉。③接种：将小鼠麻醉后，右侧卧位置于操作台上，对小鼠腋下剪毛并用乙醇消毒，在左腋前线肋弓上约1.5 cm处作一个5 mm大小的切口，分离皮肤及皮下组织，暴露胸壁，至能看到肺叶随呼吸上下活动为止，将50 μL混有Matrigel的细胞悬液用微量进样器在室温下放置2min后，再注射至左肺上，进针深度约3 mm，注射后停针数秒，拔针后缝合切口。

1.3 病理学检测

留取小鼠肺脏、肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏行病理检测，病理HE染色按常规制备病理切片，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ20 min，100%乙醇5 min，95%及85%乙醇各1 min，自来水冲洗片刻，苏木素染色10 min，自来水冲洗15 min，0.5%伊红染色1 min，自来水冲洗，95%乙醇片刻，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，中性树脂胶封片，显微镜下观察小鼠肿瘤灶。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况

每日8:00～9:00用电子秤测量，精确到1/100 g，小鼠体重变化曲线(图1)。小鼠在术后体重逐渐下降，在第4天下降至最低点，此时的体重下降考虑因手术创伤所致，饮食及饮水减少，之后体重又逐渐上升，在术后第14天，体重达到最重，考虑随着手术创伤的恢复，小鼠饮水、进食恢复，生长正常，未影响小鼠发育。此后体重再次逐渐降低，考虑是由于肿瘤负荷增加，小鼠的消耗增加所致。随着肿瘤的进一步增大，小鼠进食、进水量少，逐渐出现恶病质的现象，直至死亡。随着病情的进展,小鼠活动减少，皮毛失去光泽，有卷曲脱落的现象，在后期出现弓背，说明其呼吸困难，并伴有呼吸加深加快的现象(图2，彩插14)。

图1 小鼠体重变化曲线

图3 5只小鼠生存曲线图

2.2 原位肺癌的形成与小鼠的生存情况

肺内肿瘤接种后第4天，小鼠肺组织内无肿瘤形成，接种后第7天处死的5只小鼠中，3只肺表面肉眼可见小的瘤结节形成，其余2只肺表面未见肉眼瘤结节形成，但可在病理HE染色检查的显微镜下发现肺内有小的瘤结节形成。肺内肿瘤接种后第10天处死的所有小鼠肺表面肉眼均可见瘤结节形成，接种后第13天，尚可见胸膜转移和血性胸腔积液。接种后第25天，有1只小鼠出现上述转移的同时还出现了心包膜转移及肾脏远处转移。5只小鼠生存期分别为17、20、22、22、25 d(图3)，小鼠中位生存期为21.2 d(17～25 d)，(图3)。成瘤率100%。解剖情况见图4(彩插14)。

2.3 病理学检测结果

肺原位肿瘤周围看到肺泡受压萎缩、肺周围组织遭受浸润、肺泡壁增厚、炎性细胞增多。肺原位肿瘤细胞形成大小不等、形状不一、排列不规则的癌巢。细胞分化差，核大，深染，核质比增大，核分裂相多见。图5为腺癌病理特点(图5见彩插15)。

3 讨论

目前，小鼠肺癌模型的建立方法多种多样。多采用诱发性，移植性或转基因动物模型，其中移植性动物模型又分为原位移植模型及异位移植模型。国内应用移植动物模型的较多，以异位移植动物模型最多见。

诱发性动物模型：在mouse-inbred鼠系中，自发性肺肿瘤的发病率和易感性很高，此品系的小鼠对于化学诱导肺癌也是非常敏感的，例如，曝光、吸烟、焦油或其他化学致癌物质。应用化学致癌物诱导肺肿瘤可重复性好，几乎无一例外的导致腺瘤和腺癌。目前，诱发性肺癌动物模型的复制方法有吸入致癌物诱发肺癌，口服致癌物诱发肺癌，肺内或支气管灌注致癌物诱发肺癌等[3]。但诱发性动物模型也存在着不可忽视的问题，此种动物模型成瘤时间长，如张朝晖等[4]用BALB/c小鼠吸入烹调油烟诱导肺癌，成瘤周期为8个月，有些实验诱导成瘤周期甚至为十几个月，而且由于饲养时间长，实验费用也随之增加，实验者在予以动物长期致癌物暴露的同时，自己也会暴露于致癌物下，由此可造成不可估量的后果，因此在动物实验中不易推广。

随着转基因技术的兴起，将人类肺癌中发现的癌基因导入鼠系肺组织，或者运用基因敲除技术将抑癌基因敲除来制造肺癌模型即为转基因肺癌动物模型[5]。然而，经典的转基因敲除技术所制造出的小鼠不能反映出潜在的散发肿瘤的生长事件，为此人们制造了第二代基因鼠，第二代基因鼠运用癌基因或抑癌基因的等位基因突变技术使鼠肺肿瘤的生长更接近散发肿瘤生长流程，即在肺已完全发育的成年鼠中仅一个亚群的细胞获得突变[3]。此种动物模型要求技术条件高，并且此方法小鼠肿瘤发生率为散发，成瘤率低，由于其为自然成瘤，所以在成瘤周期上也相对较长。

异位移植动物模型目前在国内外应用最为广泛，以皮下注射瘤细胞为主，其优点是操作简单，易于接种及观察成瘤情况等。如Keshamouni等[6]将A549瘤细胞注射至小鼠任意一侧背部皮下制作肺癌模型。但如前所述，这种模型小鼠出现的症状、并发症、一般状态等与临床患者情况存在一定的差距，很难如实反映肿瘤的自然发生发展情况。

原位移植肺癌动物模型是将肿瘤细胞或组织块原位移植到动物呼吸系统的组织内，使之产生肿瘤及形成自发性转移灶。Zou等[7]用细针将人肺癌细胞系H358和H460送至裸鼠的气管内构建肺癌原位移植模型，但其肿瘤生长部位、数目及大小都不稳定。魏淑珍等[11]运用EGFP标记的人肺癌细胞接种于BALB/c(nu/nu)裸鼠皮下，待肿瘤长大后将其剥离，剪碎成1 mm大小瘤块缝合于小鼠左肺，关闭胸腔用注射器抽吸胸腔空气成负压，此种方法操作较本实验更为复杂，手术时间长，术中死亡4只，其余16只安全度过手术，死亡率高，小鼠术后恢复慢，尤其在裸鼠中，易形成术后感染而死亡。本实验所建模型同属于原位移植模型，在前人的基础上，在Leiws细胞悬浮液中加入Matrigel胶，更好的在肺原位形成肿瘤,减少手术时间，操作简化，不用开胸手术，降低因手术所致的死亡率，肿瘤的发生、发展更趋近于人类肺癌的自然过程。

Matrigel是从能产生基底膜的ESH小鼠肉瘤中提取的蛋白质。其主要成分由层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。 Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。目前，Matrigel主要用于肿瘤细胞体外3D培养；肿瘤异种移植模型的建立；筛选高侵袭力肿瘤细胞。Olsen等[8]在体外，利用Matrgiel及多条件培养基 3D立体培养人的乳腺癌细胞，并得出结论：人的乳腺纤维细胞可以在3D培养的条件下，激发乳腺癌细胞的侵袭性，并增加体外小鼠异位移植模型中基质的生成。McDaniel等[9]利用人乳腺癌细胞MDA-MB-231混入Matrigel注射于裸鼠乳腺脂肪垫内，形成原位乳腺癌异种移植模型。Soto-pantoja等[10]利用人肺癌A549细胞悬液按1∶1与Matrigel混用，注射于裸鼠侧腹，并用这一模型进行两种药物的比较。Matrigel在高侵袭力肿瘤细胞筛选的原理为，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)被具有侵袭力的肿瘤细胞分泌的多种丝氨酸蛋白酶以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)降解，细胞因此穿过Matrigel到达胶的另一面，培养一段时间后，胶的另一面所出现的细胞即为具有侵袭力的细胞，多次重复这一实验，可筛选出高侵袭力的肿瘤细胞。本实验利用Matrigel在室温下短时间可形成三维基质结构，使肿瘤细胞在肺原位固定生长，并且Matrigel组成成分中，如各种蛋白及生长因子等，均为肿瘤形成不可或缺的营养成分，有益于肿瘤细胞的快速生长。

Xu等[2]应用A549肺癌细胞悬液加入等量的Matrigel中，注射至裸鼠的皮下组织中，本实验优化其方法，将Lewis细胞悬液加入等量的Matrigel中，注射至C57BL/6小鼠的左肺上，以建造其原位模型。本实验优点在于应用免疫正常的小鼠做实验，更好的模拟了人的免疫反应，并且避免因裸鼠较贵，而使实验成本增高；Lewis细胞种于肺上后，如图5所见，肺原位肿瘤细胞形成大小不等、形状不一、排列不规则的癌巢。细胞分化差，核大，深染，核质比增大，核分裂相多见，与人类肺癌特点相似[12]；利用Matrigel构建了细胞生长的三维立体空间结构，有利于其早期成瘤，缩短实验时间，相对于其他实验没有用Matrigel而直接用氯化钠悬浮细胞注射肺部的原位模型，其中位生存期长，且直接用氯化钠悬液会至细胞分散，细胞悬液大多漏入胸腔中，形成多个结节；本实验从成瘤至中位生存期(21.2 d)长，便于实验目标的观察；本实验对于注射入小鼠肺的细胞液体量做过预实验，预实验中细胞悬液及Matrigel的总量为100 μL，解剖小鼠发现，其肺部成瘤小，而胸腔内转移多，考虑相对于小鼠肺的大小来说细胞液量偏大，有部分液体在还未因Matrigel凝固前，已流入胸腔内，故此模型操作时，混悬液需在室温下放置2min左右，注射入肺的过程需缓慢，注射后停针数秒再拔针，可有效避免该情况的发生。本实验也有不足之处，由于是肺内原位成瘤，不如皮下成瘤便于观察肿瘤大小情况，如果想确切观察其全身肿瘤转移情况，可利用影像进行观察；由于小鼠成瘤率高，成瘤时间短，不易出现远处转移，本实验肉眼观察可见有胸腔内及肺上、心脏转移，远处转移仅见于肾脏，其余远处转移未见；另外，由于手术创伤性比较大，会在术中或术后几天内，小鼠因创伤等原因死亡现象，尤其在操作不熟悉时，易发生；并且操作难度高，要求技术纯熟。

综上所述，利用Matrigel建立Lewis肺癌原位模型，虽操作难度高，但由于其能更好的模拟人肺癌的发生、发展过程，故此方法有进一步推展的价值。

(本文图2,4见彩插14,彩5见彩插15。)

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