睾丸酮对大鼠前列腺上皮细胞有丝分裂方向的影响

刘向云，桂博，潘琦，许丽，孙祖越

(1.上海市计划生育科学研究所，上海 200032； 2.上海体育学院，上海 200438)

我国已步入老龄化社会，《中国人口和就业统计年鉴—2011》资料显示，2010年全国65岁及以上的老年人达11894万人，占总人口的8.9%，估计到2025年我国老年人口比例将占全国人口20%左右。前列腺增生在老年男性中的发病率非常高，达到50%以上[1]。众所周知睾丸酮在男性前列腺增生性疾病中发挥着重要作用，但是其引发前列腺增生的机制还不是十分清楚。细胞增殖和染色体有丝分裂分不开，曾有研究发现雌激素可以改变大鼠子宫细胞染色体有丝分裂的方向[2]，本研究将从雄性动物着手，观察睾丸酮对前列腺细胞染色体有丝分裂方向的改变并初步探索其发生机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠20只，110～130 g，4～5周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2008-0016】。动物饲养在上海市计划生育科学研究所SPF级动物房内【SYXK(沪)2008-0027】，饲养于400 mm×350 mm×200 mm塑料笼内，每笼饲养同性大鼠5只，自由饮水、摄食。室温20～26℃，相对湿度 40%～70%，光照12 h，黑暗12 h。随机分为两组，对照组和给药组，每组各10只。在实验前，所有大鼠在深麻醉下去势。

1.2 材料

Rabbit anti-adrogen receptor：单克隆抗体，购自福州迈新生物技术有限公司，批号：BA0004；规格：0.2 mL(200 μg/mL)；DAB显色试剂盒：福州迈新生物技术有限公司，批号：050324；多聚赖氨酸：Sigma公司生产，华美生物工程有限公司分装，批号：ISP8920；丙酸睾丸酮 (testosterone propionate)(批号：010504，华联制药公司)。

1.3 动物分组及造模

采用SD大鼠实验, 随机分成对照组和实验组，以1.0%的氯胺酮作50～100 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠四肢及头部固定于手术板上，腹部碘伏消毒后，从尿道上端约l cm处正中切开皮肤约1 cm，逐层分离进入腹腔，沿脂肪找到睾丸，结扎系膜血管，切除双侧睾丸和附睾，关腹。消毒、对皮。术后肌注庆大霉素每只0.1 mL，预防感染。恢复一周后，开始给药，对照组注射橄榄油每只0.1 mL，给药组注射丙酸睾酮(每只0.5 mg)0.1 mL[3]，均给药一个月(30d)。每天皮下注药一次，每周根据动物体重变化调整给药剂量。于最后一次给药后24 h取血、处死、取材。测量前列腺体积、湿重、计算前列腺系数。

1.4 取血和取材

在深麻醉下，打开腹腔，经腹主动脉取血，离心，取上层血清，-20℃保存待测。立即取出前列腺、称重和测量体积，固定于甲醛中。

1.5 病理制片和免疫组化

前列腺组织固定并制成蜡块。制作5 μm石蜡切片用于铁苏木素染色。并购买雄激素受体(AR)免疫组化试剂盒，按照说明进行染色。二甲苯脱蜡3次，每次10 s；无水乙醇洗去二甲苯两次，每次5 s；依次酒精浓度从高到低梯度水化，微波修复抗原后，加一抗(1∶50)，孵育1 h(37℃)二抗孵育20 min(37℃)DAB显色后终止反应，苏木素复染后，在显微镜下观察。

1.6 基因芯片检测

采用大鼠全基因组芯片对两组大鼠基因进行检测，把大鼠前列腺RAN提出，按照组别分别把各组所有的RNA混合后检测。检测仪器和软件：GeneChip Scanner 3000：Affymetix；GeneChip operating software： Affymetix。

1.7 实时定量PCR检测

使用样品RNA进行cDNA合成后，制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板，进行实时定量PCR检测。

1.8 统计方法

以SPSS 11.5统计分析软件包对实验数据进行整理和分析。用单因素方差分析进行多组均数比较，再用最小显著差数法(LSD法)进行两两比较，以检测哪几对均数间的差别有显著意义。

RT-PCR结果分析方法：各样品的目的基因和管家基因分别进行real-time PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

2 结果

2.1 大鼠前列腺标本铁苏木素染色

正如我们预期结果，对照组大鼠前列腺发生形态学萎缩，注射睾丸酮(T)导致前列腺细胞增殖活跃，且前列腺上皮细胞有丝分裂的方向与基底膜平行 (染色体有丝分裂方向与基底膜夹角在0～45°，见图1), 但是对照组前列腺上皮细胞有丝分裂的方向与基底膜垂直 (染色体有丝分裂方向与基底膜夹角在45°～90°，图1)。T 的注射导致前列腺上皮细胞有丝分裂方向发生了改变。T注射后与基底膜平行的前列腺上皮细胞数分别为7.9%。图1见封底。

2.2 雄激素对前列腺雄激素受体表达的影响

T给药组，经雄激素受体(AR)免疫组化染色观察，给药组均有 AR阳性表达，腺细胞核内可见大量亮黄褐色颗粒，为AR表达(见图2，封底)，而对照组AR无明显表达。

2.3 大鼠基因芯片结果

基因芯片检测到一些促进细胞增殖的基因如雄激素受体相关蛋白(RAN)、细胞周期调节因子(ODC1)和Wnt通道的Wnt2等基因均上调，而抑制细胞增殖的基因如负调控Wnt通道的DKK3和促进细胞凋亡的FAS等基因下调(见表1)。

表1 T组与对照组差异基因表达

2.4 实时定量PCR结果

实时定量PCR时各样品加样量均为1 μL，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1 μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因β-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量(见表2和图3，图3见封底)。

表2 RT-PCR基因相对表达量

3 讨论

长期暴露于T，前列腺上皮细胞有丝分裂的方向发生改变，提示我们可以从新的角度研究T促进前列腺的增殖作用[4]。从铁苏木素染色和AR免疫组化结果，可以看出前列腺是T的靶器官，长期暴露于T，引起前列腺细胞增殖和细胞有丝分裂方向的改变。由于对照组的前列腺上皮细胞未见明显的细胞增殖和有丝分裂方向与前列腺基底膜平行现象，所以这一现象的机制可能和雄激素受体信号转导通路相关。WNT信号转导通路是近二、三十年发现的信号分子家族，它在许多增生性疾病的发生和发展过程中，发挥着重要作用[5, 6]。这一现象也可能和WNT信号转导通路相关[7, 8]。

据此，我们对28,000多个大鼠基因进行了分析，并通过RT-PCR试验进行验证。证实WNT信号转导通路和AR激素受体信号转导通路，参与了雄激素对前列腺上皮细胞的有丝分裂的影响。与对照组相比，本实验暴露于T的大鼠，WNT2等正调控基因上调，而DKK3等负调控基因下调。DKK通过结合及激动LRP5/6受体，以及促进溶酶体对它们的细胞内摄作用，而抑制Wnt通道的[9,10]。目前对DKK家族了解较少，尤其是DKK-3。有研究证明前列腺癌细胞中缺少DKK-3基因[11]，其表达量增加可以抑制肿瘤的发展[12]。但对其在良性前列腺增生中的作用，研究罕见。本实验发现，给予去势大鼠T，DKK-3的表达较对照组下调。而T亦是诱发良性前列腺增生模型的药物[13]。由此可见，DKK-3基因下调致使抑制细胞增生和分化的作用下降，也可以导致前列腺细胞良性增生[14]。WNT2参与经典WNT信号转导通路刺激细胞增殖，参与调节成纤维细胞和上皮细胞的衰老过程，在衰老细胞中可以检测到WNT2依赖信号下调[15]。由于WNT2的高表达刺激前列腺上皮细胞核分裂增多，激发WNT信号通路，改变前列腺上皮细胞极性[7]，可能从此途径造成前列腺上皮细胞染色体的改变。

而AR受体是重要的基因调节蛋白，它是细胞内雄激素通路的重要中间体[16]。长期慢性的雄激素刺激可以促进分泌性上皮细胞表达出AR受体。而存在于前列腺上皮基底细胞的亚型被认为是表达干细胞，干细胞衰老和损伤的分子机制是老年性疾病(如BPH和肿瘤等)的重要诱发原因[17]。前列腺基底细胞不依赖雄激素存活，而雄激素存在时引发其增殖和分化[18]，是引发前列腺细胞增殖的机制之一。TGM4是AR信号转导通路的基因之一，其在正常和异常前列腺中均有表达，很多研究均把TGM4作为前列腺上皮细胞特征性标志物的候选标志物[19]。T组大鼠前列腺组织TGM4上调，促进了前列腺细胞的增殖。本实验T给药组FAS基因下调，抗细胞凋亡能力下降[20]，细胞凋亡减少，可致前列腺细胞发生增殖。RAN是RAS家族的成员，参与雄激素信号转导途径，正调控DNA转录。对RAN和前列腺癌的关系研究较多，但是对它和前列腺良性增生的关系研究甚少。在本实验中经RT-PCR验证，RAN基因较对照组上调，它在BPH中也参与了细胞的增殖过程。AR在正常和异常前列腺中均发挥着重要作用，AR受激素与受体结合后共同调节，许多共同调节点和RAS家族有关。最近有研究发现RAS反应成分结合蛋白(RREB-1)是AR的配体和共同调节体可以抑制AR功能。RAS/MAPK激酶通路可以对抗RREB-1对雄激素信号转导通路的抑制作用[21]，RAN作为RAS的一员参与了这一过程，从而促进前列腺细胞增殖。此外，Ran还参与有丝分裂纺锤丝组织和生物发生，可能通过该机制改变了前列腺上皮细胞的有丝分裂方向。Krüppel-like5因子在RAS介导的转化中，通过激活细胞周期调节蛋白B1/Cdc2 复合物，从而促进了细胞的有丝分裂[22]。

T可以改变前列腺上皮细胞的染色体有丝分裂的方向。WNT和AR信号转导通路参与了这一过程，Krüppel-like5因子在这一现象中的作用，仍需继续深入研究。

(本文图1～3见封底)。

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