利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

皮文辉，梁龙，唐红，张译元，郭延华，王立民，向春和，周平，刘守仁

(1.新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆 石河子 832000；

2.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐 830013；3.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003)

1987年Gordon等[1]采用原核显微注射转基因技术，获得乳腺生物反应器小鼠模型。随着转基因技术体系的发展，乳腺生物反应器的研究也取得了相应发展。酪蛋白是哺乳动物乳中主要的蛋白组份，根据结构划分为4类：αs1、αs2、β和κ[2]。哺乳动物β-酪蛋白基因在乳腺中高表达[2,3]，皮肤[4]和有毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes)[5]中也表达。敲除β-酪蛋白基因小鼠能够正常生长、繁殖和哺育后代[6]。β-酪蛋白基因启动子是构建乳腺生物反应器表达框的候选启动子。

为证实β-酪蛋白基因启动子驱动的表达框是否有效，Kolb等[7](1999)采用乳腺上皮细胞。国内乳腺生物反应器研究方面，也采用乳腺上皮细胞验证乳腺特异性表达框的有效性[8]。如果能够在成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子，检测重组表达框的表达结果，将为β-酪蛋白基因启动子表达载体检测，提供另外一种简便的检测途径。

快速发展的转录激活样效应子(transcription activator-like effector, TALE)技术，已经成为基因组编辑(genome editing)和基因转录调控(transcriptional modulation)的有效工具[9,10]。TALE来源于黄单胞杆菌(Xanthomonassp.)，TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含34(33～35)个氨基酸，单元的第12和13位氨基酸高度可变，称为重复可变区(repeat-variable diresidues, RVDs)[11]。TALE的RVDs识别DNA序列的4个碱基具有高度的专一性，TALE重复单元的第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合[12,13]。研究者几乎能够针对任何DNA靶序列，构建特异性TALE-DNA结合域，在靶向改变基因序列和调控基因表达方面具有广泛的用途。

TALE—TF代表TALE-TFs靶向位点；TATA代表TATA box；E1代表β-酪蛋白基因第一外显子；Red-polyA代表红色荧光蛋白基因和Sv40 polyA序列

TALE-DNA结合域串联VP64转录激活因子，构成TALE转录因子(TALE transcription factors, TALE-TFs)。TALE特异结合DNA，VP64同真核细胞内转录因子作用，招募RNA聚合酶和其它因子，稳定转录前起始复合体(transcription preinitiation complex)，间接调控特定基因转录[14,15]。TALE-TFs即能提高表达基因的转录水平，还能激活在特定细胞中不表达的基因[15-17]。本研究利用TALE-TFs，在小鼠成纤维细胞中，成功激活β-酪蛋白基因启动子，为检测β-酪蛋白基因启动子—外源基因表达框表达结果，提供了一种检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物

SPF级KM鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】。雌雄各2只，10周龄，雄鼠体重36g，雌鼠体重30g，饲养在新疆农垦科学院实验动物房，自然交配后，取妊娠18d的KM孕鼠，留待实验。

1.1.2 试剂

TALE Toolbox试剂盒(Addgene，1000000019)。Herculase II fusion polymerase 购自Agilent Technologies；Esp3I(BsmBI)、AfeI购自Fermentas；BsaI-HF购自New England Biolabs；T7 DNA ligase购自Enzymatics；PlasmidSafe ATP-dependent DNase购自Epicentre；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；1 kb DNA ladder购自北京全式金生物技术有限公司；Marker VII、DH5a大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料GELVIEW购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 小鼠β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因表达载体构建

本实验室应用“Golden Gate”克隆法构建β-酪蛋白基因启动子——红色荧光蛋白(Red)报告基因表达载体pEGFP-N1-mE1-HR[18]。该载体表达框由小鼠β-酪蛋白基因启动子调控序列和TATA box、第1外显子、信号肽序列、Red基因和poly A 片段组成，形成一个完整的表达框，包含TALE-TFs结合位点(图1)。

1.3 小鼠β-酪蛋白基因TALE-TFs靶点设计

由于TALEs的可编辑属性，在目标基因序列上几乎可任意选择靶序列结合位点。对于TALE-TFs构建，可在启动子近端区域内选择一段DNA序列作为靶序列，进行TALE识别模块构建。为有效地防止脱靶效应，构建TALE的靶序列不应过短，一般建议16-30 bp。本实验选择长度19 bp，遵循5‘端以T碱基起始原则(图2)。TF1对应的RVDs排列是HD-NG-NG-NN-NN-NI-NI-NG-NG-NN-NI-NI-NN-NN-NN-NI-HD-NG;TF2对应的RVDs排列是NN-NI-NI-NN-NN-NN-NI-HD-NG-NG-NG-NG-NG-NN-NI-NN-NG-NI-NG；TF3对应的RVDs排列是NG-NN-NI-NN-NG-NI-NG-HD-NG-NG-NI-HD-NI-NI-NI-HD-HD-NI-HD。

图2 小鼠β-酪蛋白基因启动子的TALE-TFs靶点序列(方框是TATA box序列)

1.4 TALE-TFs构建程序

实验采用Zhang等的TALE构建程序[9,19]。经两轮PCR扩增和“Golden Gate”克隆反应构建TALE-TFs真核表达质粒。用AfeI酶切鉴定TALE-TFs构建结果。

1.5 小鼠原代成纤维细胞分离和培养

选妊娠18 d的KM孕鼠，安乐死，取出胎鼠，采用组织块培养法，培养液是DMEM，添加15%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素， 37℃、5% CO2饱和湿度环境培养，获得小鼠原代成纤维细胞。每隔2 d换培养液1次，5 d传代1次。当成纤维细胞覆盖培养皿底部80%～90%时，进行传代。用PBS溶液洗细胞2次，2%胰蛋白酶溶液消化细胞1～3 min。当细胞形态变圆时，加入含血清15%的DMEM培养液终止细胞消化。用移液器轻轻吹吸，至培养皿底部的细胞完全漂浮起来。将细胞悬液转移至离心管中，400 g离心10 min。保留细胞沉淀，弃去上清。加入1 mL培养液充分悬浮细胞，将该悬浮细胞转入细胞培养皿中，添加适量培养液，混匀细胞，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.6 质粒电转染程序

除内毒素的TALE-TF和pEGFP-N1-mE1-HR Red报告基因表达质粒按1∶1质量比混合，采用Amaxa电转仪将质粒导入小鼠成纤维细胞。培养成纤维细胞至90%密度，胰酶消化。1∶50倍混合Nucleofection S1和S2电转液，100 μL电转液混悬3×106细胞，分别加入2 μg的TALE-TF和pEGFP-N1-mE1-HR质粒，转入电击杯中，采用CZ-165程序实施电转染。电转染后静止10 min，补加800 μL培养液悬浮电击杯中细胞，将细胞转入培养皿中培养。电转细胞6 h换液1次，36 h观察细胞荧光蛋白基因表达效果。

2 结果

2.1 TALE-TFs构建酶切检测结果

AfeI酶切鉴定构建的TALE-TFs真核表达质粒。正确组装的TALE-TFs质粒，酶切产生DNA条带大小是167、2118、3435和3544 bp，其中2118 bp的DNA片段，是18个RVD的串联重复体(图3)。

注：M1：Marker VII； M2：1 kb DNA ladder； TF1、TF2和TF3是AfeI酶切的人工转录因子；HD是AfeI酶切的pTALETF_v2 (HD) 骨架载体

AfeI酶切构建的TALE-TF质粒，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳运行8 min时，165 bp片段清晰可见。经长时间电泳，各酶切片段分开后，很难看清165 bp片段。3435 bp和3544 bp条带，用1.5%琼脂糖凝胶电泳很难分开，故TALE-TFs质粒酶切长时间电泳可见2条DNA带。

2.2 TALE-TFs激活pEGFP-N1-mE1-HR红色荧光蛋白报告基因表达质粒

细胞电转染后培养72 h，用Laica倒置荧光显微镜观察。分别在自然光、绿色荧光和红色荧光光源下观察细胞发光效果，确定报告基因表达结果。图4是TF2人工转录因子观察结果，显示出红色荧光蛋白报告基因表达结果。TF3处理细胞组，有很弱的红色荧光显现，图像未列出。TF1人工转录因子处理细胞组，未见到红色荧光蛋白表达细胞。

比较分析同一视野下3种不同光源成像的图片(图4，彩插3)。由于构建的TALE-TFs表达质粒中含有串联表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因，当表达TALE-TFs蛋白时，GFP也表达。图片b和c比较可以看到，1，2，3和其他标注细胞呈对应关系，这些细胞即发绿色荧光也发红光荧光；而且部分发绿色荧光的细胞未发红色荧光。只转染TALE-TFs对照试验，在红色荧光下观察细胞，未显现荧光，是黑暗视野；只转染β-酪蛋白基因启动子驱动的Red基因质粒，在红色荧光下观察细胞，未显现红色荧光，是黑暗视野(图片未列出)。说明在成纤维细胞中，TALE-TFs能够激活质粒中β-酪蛋白基因启动子。

3 讨论

由于TALE-TFs的RVDs序列高度重复，实验室构建的TALE-TFs实施测序较难。根据TALE-DNA结合分子密码，针对基因组靶位点设计TALEs，不同的TALEs具有不同的活性，可能与上下文依赖效应或染色体状态有关[19]。为了得到具有一定活性的TALE-TF，构建多个TALE-TFs，转染体外培养细胞，筛选有生物学活性的TALE-TFs，能够解决TALEs的难以测序问题和靶向局限性。本实验针对小鼠β-酪蛋白基因启动子序列，设计构建了3条TALE-TFs，获得了1条有活性的TALE-TF人工转录因子。在成纤维细胞中，该TALE-TF能够激活β-酪蛋白基因启动子，为在成纤维细胞中进行检测β-酪蛋白基因启动子——外源基因表达框是否能够正常表达，提供了一条代替乳腺上皮细胞检测系统的方法。

(本文图4见彩插3。)

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