抵当颗粒剂体外抗凝血与抗血栓作用的研究

梁珊珊，吕金南，张瑞光，孙小文，郭晶，侯慧，徐炳清，王秋红，匡海学

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

抵当汤出自《伤寒论》，见于“太阳病，六七日表证仍在，脉微而沉，反不结胸，其人发狂者，以热在下焦，少腹当硬满，小便自利者，下血乃愈。所以然者，以太阳随经，瘀热在里故也，抵当汤主之”。方剂组成为水蛭、虻虫、桃仁、大黄，破血逐瘀之功效甚强，主治下焦瘀热证［1］，症状为少腹急结或疼痛固定不移、或拒按、大便失常，其色如柏油，小便自利，发狂，或喜忘、或起卧不安、或身黄等。现代临床将抵当汤进行改良后应用于脑血管病变，代谢综合征，周围血管症，妇科疾病等，主要取活血化瘀的功效［2］。本实验室根据临床经验，并参考《伤寒论》以抵当汤为基础，结合现代临床用药，制成抵当颗粒剂，对其活血化瘀的各项功能指标进行研究。

1 材料与仪器

1.1 动物

新西兰大耳白兔，雄性，体质量(2.5 ±0.2)Kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂

凝血酶、牛纤维蛋白原(北京索莱宝科技有限公司);生理盐水(哈尔滨三联药业);枸橼酸钠(北京康普汇维科技有限公司);自制抵当颗粒剂(由黑龙江中医药大学中药化学教研室自制)。

1.3 实验仪器

恒温水浴锅(武汉明思克化仪器有限公司);电热恒温培养箱HH·B11·500(上海跃进医疗器械厂);分析天平(BSA2245，德国赛多利斯集团)。

2 试验方法

2.1 实验药品的制备

用去离子水精确配制抵当颗粒剂样品的浓度，分别为 100.0、250.0、500.0、750.0μg/mL 和 1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL，分别标记为 A，B，C，D，E，F，G，H，并于冰箱内保存，供实验用。

2.2 体外抗凝血作用［3］

2.2.1 对家兔血浆复钙时间的影响

家兔耳缘静脉取血4.5mL，加至含有38g/L枸橼酸钠0.5mL的10mL离心管中，混匀，3000r/min离心10min，取上清液，4℃备用。另取96孔板1个，实验组每孔加入混合血浆0.1mL及不同质量浓度的样品溶液各0.1mL，对照组加入混合血浆0.1mL及生理盐水0.1mL，于37℃温育1min后分别向每孔加入2.775g/L CaCl2溶液0.1mL后开始计时，直到检测到纤维蛋白丝时停止计时，重复10次，求平均值，即为血浆复钙时间。

2.2.2 对凝血酶时间的影响

按“2.2.1”项的方法制备混合血浆，在96孔板中加入混合血浆和不同质量浓度(同“2.2.1”项)的样品溶液各0.1mL，37℃温育3min，再加入已预温的1×104U/L凝血酶0.1mL，混匀，记录血浆凝固所需的时间。以生理盐水为对照组，每组重复10次，取平均值。

2.3 体外抗血栓作用［3］

2.3.1 溶栓作用

家兔颈总动脉采血于试管中，按体积比为1∶9加入质量浓度为38g/L枸橼酸钠溶液，然后依次加入纤维蛋白原溶液(质量分数为 0.5%)、CaCl2溶液(55.5g/L)和凝血酶溶液(1.0×105U/L)，加入量为每毫升血中加入纤维蛋白原溶液20μL、CaCl2溶液10μL和凝血酶溶液20μL。混匀后，注入到内径为8mm的玻璃试管中，37℃水浴20min后取出血栓，用滤纸吸干，切成5mm的小段，放入装有不同质量浓度(同“2.2.1”项)的样品溶液和生理盐水2mL的试管中，37℃温育，于 0、4、12、24、48h 内分别测定剩余血栓段的质量，计算血栓溶解率［4］，各药物重复测定10次。

血栓溶解率(%)=(血栓初始质量－药物作用后各时间点血栓质量)/血栓初始质量×100%

2.3.2 对全血凝块的溶解作用

家兔颈总动脉采血20mL置于表面皿中，2h后自然凝固后切成0.3cm3的小块，用生理盐水淋洗3遍待用。将不同质量浓度(同“2.2.1”项)的样品溶液和生理盐水各2mL分别加入不同的安瓿瓶中，每组5小瓶，再向各瓶中随机加入2个血块，37℃水浴保温，观察血块溶解情况，并分别于0、12、24、48h分别测定血块的质量，计算全血凝块溶解率。

全血凝块溶解率(%)=(血凝块初始质量－药物作用后各时间点血凝块质量)/血凝块初始质量 ×100%

3 实验结果

3.1 体外抗凝血作用

3.1.1 对家兔血浆复钙时间的影响

如表1所示，与对照组比较，低剂量组无显著性差异;随着浓度的增大，抵当颗粒组能延长家兔血浆复钙时间，具有显著性，且呈量效关系。

3.1.2 对凝血酶时间的影响

如表1所示，抵当颗粒剂具有延长凝血酶时间的作用，随浓度的增加作用越显著，且呈量效关系。

表1 抵当颗粒剂对家兔血浆复钙时间及凝血酶时间的影响(s，n=10)

表1 抵当颗粒剂对家兔血浆复钙时间及凝血酶时间的影响(s，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

组别 浓度(mg/ml)血浆复钙时间(s)凝血酶时间(s)对照组41.99 ±3.13 90.27 ±8.95 A 0.10 43.86 ±4.91 101.55 ±8.66 B 0.25 46.78 ±5.17 104.69 ±9.71 C－0.50 52.26 ±7.20＊＊ 110.45 ±12.10＊＊D 0.75 57.13 ±7.87* 117.28 ±13.79*E 1.00 63.06 ±8.32* 125.68 ±15.84*F 2.00 71.25 ±9.67* 138.64 ±15.34*G 3.00 76.43 ±11.43* 144.78 ±16.51*H 4.00 84.84 ±12.43* 150.89 ±20.93*

3.2 体外抗血栓作用

3.2.1 溶栓作用

如表2所示，随着给药时间的延长，各实验组的血栓溶解率也逐渐增大，血栓变得松散，渐渐呈颗粒状。与对照组相比，浓度为 0.10、0.25mg/ml的低浓度组别无溶血栓作用外，其他各实验组均有显著性的溶栓作用，并且，在供试量范围内样品浓度为4.00mg/ml时达到最强溶栓作用。

3.2.2 对全血凝块的溶解作用

与对照组相比，各样品组在不同的时间点均显示出较强的溶解全血凝块的作用，并随着给药时间的延长，全血凝块溶解率也依次增大，在供试品范围内，浓度为4.00mg/ml时，达到最大全血凝块溶解率，见表3。

表2 抵当颗粒剂对家兔体外血栓的溶解作用(s，n=10)

表2 抵当颗粒剂对家兔体外血栓的溶解作用(s，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

4h 12h 24h 48h对照组 16.43 ±1.13 42.03 ±4.36 48.57 ±5.49 56.87 ±6.86组别 血栓溶解率(%)A 17.11 ±1.36 46.24 ±6.01 53.93 ±6.54 67.40 ±7.70 B 19.01 ±2.94 50.29 ±6.93 59.61 ±7.63＊＊ 71.14 ±8.48＊＊C 22.07 ±4.80 55.38 ±8.41* 63.54 ±9.43* 74.35 ±10.22*D 26.08 ±5.64＊＊ 59.05 ±8.30* 68.02 ±11.99* 79.44 ±12.55*E 33.71 ±8.95* 63.08 ±9.33* 72.37 ±10.22* 83.39 ±11.73*F 41.06 ±9.44* 68.33 ±7.51* 78.15 ±9.94* 86.41 ±10.90*G 47.86 ±9.55* 72.39 ±7.64* 82.24 ±8.43* 90.12 ±10.38*H 54.22 ±10.46*79.90 ±8.35* 84.64 ±7.56* 93.19 ±8.67*

表3 抵当颗粒剂对家兔体外全血凝块的溶解作用(s，n=5)

表3 抵当颗粒剂对家兔体外全血凝块的溶解作用(s，n=5)

注:与对照组比较，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

12h 24h 48h对照组组别 全血凝块溶解率(%)18.28 ±2.33 26.66 ±5.83 39.73 ±6.93 A 28.59 ±5.57＊＊ 38.07 ±8.19＊＊ 51.44 ±8.00＊＊B 32.03 ±6.43* 45.33 ±8.79* 55.75 ±7.35*C 36.03 ±7.24* 49.71 ±8.32* 60.17 ±7.61*D 41.14 ±8.29* 53.36 ±7.73* 65.98 ±8.32*E 47.04 ±8.89* 58.21 ±7.48* 72.77 ±8.24*F 53.11 ±8.57* 63.41 ±9.34* 77.83 ±9.59*G 58.55 ±10.17* 69.35 ±10.31* 83.68 ±9.58*H 62.63 ±10.37* 77.60 ±11.42* 90.16 ±7.32*

4 讨论

本文采用体外抗凝血与抗血栓实验，检测抵当颗粒剂对体外抗凝血及抗血栓的作用强度。在抗凝血实验中，低剂量组抗凝血效果不显著，随着剂量的增大，抗凝血效果逐渐明显，与对照组比较具有显著性差异;在溶栓作用实验中，与对照组比较，低剂量组无显著性差异，随着时间的延长，逐渐显现出差异性;随着剂量的增大，具有明显的差异性，且随着时间的延长，溶栓作用越强;在全血凝块的溶解作用实验中，抵当颗粒剂各剂量组在不同的时间点均显示出较强的溶解全血凝块的作用，与对照组比较，具有显著性差异。

实验结果直接表明了抵当颗粒剂在抗凝血与抗血栓方面具有较强的作用，这也间接的证明了抵当颗粒剂在治疗凝血或血栓引起的心脑血管疾病方面可能具有显著的疗效。其药效学关系将在有关动物体内实验中进一步研究证实。

［1］王付.经方学用解读［M］.北京:人民军医出版社，2004:384.

［2］杨奇云，虞舜.抵当汤临床应用近况［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12(5):31 －33.

［3］钟山，崔征，王东，等.水蛭注射液抗血栓与抗凝血作用［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(7):456 －458.

［4］刘秀文，汤仲明，梁心平，等.重组葡激酶对兔实验性肺栓塞的溶栓作用［J］.药学学报，1998，33(11):801 －806.