芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌收缩功能的影响

刘世超，卢轩，冯宝民，郑学仿，张宁，王惠国

(大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622)

芥子碱主要存在于十字花科(cruciferae)植物中，为季胺类生物碱，是芥子酸与胆碱形成的酯［1］。已有研究表明，芥子碱具有广泛的药理活性，如降血压［2］、抗衰老［3］、抗辐射［4］、抗氧化［5］、抗雄激素等作用［6］。本研究前期［7］对芥子碱氯化盐的降压作用进行了研究，发现芥子碱氯化盐具有较强的降压作用，作为降压药物先导化合物具有潜在的研究价值，但目前尚未见到有关芥子碱降压作用机理的研究。本文通过研究芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌收缩功能的影响，旨在考查芥子碱氯化盐对离体肠管平滑肌的作用，为芥子碱降压作用机理的研究提供线索和实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

成年健康新西兰长耳白兔，体质量2.0～2.5kg，雌雄兼用，辽宁省大连市大连医科大学医学实验动物中心提供，SCXK(辽)2013－0003。

1.2 主要仪器及试剂

Medlab－U/4C501H生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);BP 211D型电子天平(德国赛多利斯);恒温平滑肌浴槽(张家港市南港医疗器械厂);FT－100生物张力传感器(成都泰盟电子有限公司);硫酸阿托品注射液(郑州羚锐制药股份有限公司，批号1005051);氯化钠(青岛化学试剂厂，批号050616);氯化钾(河南焦作市化工三厂，批号990911);无水氯化钙(天津市广成化学试剂有限公司，批号20020504);碳酸氢钠(山东省化工研究院，批号990902);葡萄糖(青岛化学试剂厂，批号040716);MgSO4·7H2O(开原化学试剂厂，批号 990201);NaH2PO4·2H2O(天津市科密欧化学试剂开发中心，批号030828);皆为分析纯。芥子碱氯化盐为本实验室自制，经HPLC检测纯度为99.9%。

2 方法

2.1 家兔离体肠管的制备

取禁食24h家兔15只，槌击后枕部致死，迅速剖开腹腔，分离回肠，去除肠壁周围肠系膜，分离出长约30cm的肠管，立刻置于37℃充入95%O2和5%CO2的混合气体的台氏液中，肠管出现明显蠕动时剪成2cm的肠段，用台氏液把肠内容物冲洗干净后备用。

2.2 芥子碱氯化盐对家兔离体肠管收缩功能的影响［8－9］

取2.1制备的离体肠管，上端接肌张力换能器，下端固定在金属钩上，将固定好的肠管置于充满20ml台氏液(37±0.5)℃的麦氏浴槽中，打开生物信号采集处理系统，设置参数为:直流，滤波调节F=30Hz，时间扫描速度S(1.0s/div)，调整标本初负荷为2.0g，每次筛选5个舒缩频率、张力稳定的肠管进行实验，肠管蠕动平稳30min后，向5个麦氏浴槽中分别加入不同浓度(0、5、10、20、40ug/ul)芥子碱氯化盐溶液，每个浓度的给药体积为5ul，每个浓度重复15次实验，以0ug/ul芥子碱氯化盐作为空白对照，用MedLab生物信号采集处理系统软件记录并分析肠管的蠕动波形，用区间测量法测量给药前1min及给药后第5min的频率、张力，按下列公式计算频率变化率、张力变化率。

频率变化率(%)=(给药后频率－给药前频率)/给药前频率×100%

张力变化率(%)=(给药后张力－给药前张力)/给药前张力×100%

2.3 M受体阻断剂对芥子碱氯化盐收缩肠管作用的影响［10］

制备4条离体肠管，待标本舒缩平衡后，分别采用下述4种给药顺序考察芥子碱氯化盐对阿托品所致回肠舒张的影响。1)1%芥子碱氯化盐→1%阿托品(图1A);2)1%阿托品→1%芥子碱氯化盐(图1B);3)1%芥子碱氯化盐→1%阿托品→1%芥子碱氯化盐(图1C);4)10%阿托品→1%芥子碱氯化盐→10%阿托品(图1D)，每次实验给药量均为5ul。

2.4 统计学处理

采用统计软件SPSS 16.0进行数据分析，所有结果采用(s)表示，给药前后比较采用组内配对t检验，变化率比较采用方差分析。

3 结果

3.1 芥子碱氯化盐对家兔离体肠管收缩功能的影响见表1～2。

表1 芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌收缩频率的影响(n=15，s)

表1 芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌收缩频率的影响(n=15，s)

芥子碱氯化盐浓度(ug/ul)给药前 给药后频率F(次/min)频率变化率(%)0 0.249 ±0.014 0.252 ±0.015 1.67 ±0.648 5 0.243 ±0.019 0.248 ±0.013 2.75 ±0.089 10 0.243 ±0.019 0.246 ±0.050 2.02 ±0.228 20 0.249 ±0.012 0.252 ±0.016 1.32 ±0.835 40 0.246 ±0.018 0.243 ±0.008 －0.59 ±0.770

表2 芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌张力的影响(n=15，s)

表2 芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌张力的影响(n=15，s)

注:与给药前后比较，#P＜0.05，##P ＜0.01;与空白对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

芥子碱氯化盐浓度(ug/ul)给药前 给药后张力(g)张力变化率(%)0 2.038 ±0.031 2.045 ±0.036 1.596 ±0.243 5 2.095 ±0.124 2.264 ±0.091# 8.423 ±0.753＊＊10 2.062 ±0.049 2.290 ±0.121## 11.075 ±0.560＊＊20 2.077 ±0.023 2.328 ±0.118## 12.078 ±0.578＊＊40 2.137 ±0.059 2.496 ±0.220## 16.822 ±1.041＊＊

由表1可见，与给药前相比，给予芥子碱氯化盐后家兔离体肠平滑肌收缩频率变化差异不显著(P＞0.05)，芥子碱氯化盐不会引起离体肠平滑肌收缩频率的变化。由表2可见，芥子碱氯化盐给药后家兔离体肠平滑肌张力均较给药前提高且差异显著(P＜0.01)，组间比较结果显示，与空白对照组相比各实验浓度的芥子碱氯化盐均可显著提高家兔离体肠平滑肌张力，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3.2 M受体阻断剂对芥子碱氯化盐收缩肠管作用的影响 见图1。

图1 M受体阻断剂对芥子碱氯化盐收缩肠管作用的影响

图1A显示，芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用可以部分被M受体阻断剂阿托品阻断;图1B显示，芥子碱氯化盐可以拮抗M受体阻断剂阿托品所致的肠管舒张;图1A，1B结果提示，M胆碱受体途径参与了芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用。图1C显示，阿托品抑制芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用可以被再次加入的芥子碱氯化盐所逆转，提示芥子碱氯化盐与阿托品之间存在着竞争M受体的作用。图1D显示，在浴槽中预先加入封闭M受体剂量的阿托品(10%)育后再加入芥子碱氯化盐，引起的收缩小于空白对照(基线)引起的收缩，说明阿托品的确具有拮抗芥子碱氯化盐的作用，但这种拮抗作用并不完全，在封闭剂量阿托品存在的情况下芥子碱氯化盐仍能够表现出兴奋离体肠管的作用，且这种作用不会被再次加入10%阿托品逆转，提示除了M胆碱受体途径激动外，还可能存在其他途径参与了芥子碱氯化盐对肠管的兴奋作用。

4 结论与讨论

芥子碱(Sinapine)是普遍存在于十字花科植物(Folium Isatidis)中的一种天然酚类小分子季铵类生物碱。其结晶体为棕色针状，易溶于水、甲醇和乙醇，热稳定(100℃)，熔点为179℃，在326 nm处有一紫外吸收峰，在弱酸性溶液中稳定，在碱性溶液中不稳定，易分解为芥子酸和胆碱。芥子碱在自然界中只有极少一部分是以单体的形式存在，常与有机酸结合成盐存在，或以糖苷、有机酸酯和酰胺的形式存在，在十字花科药用植物中芥子碱以芥子碱硫氰酸盐的形式存在最为广泛。芥子碱硫氰酸盐溶解度不好，故本研究开展了芥子碱氯化盐对家兔离体肠平滑肌收缩功能的研究，结果发现芥子碱氯化盐的作用性质是兴奋离体肠管，且这种作用具有一定的剂量依赖性(5～40ug/ul)，为进一步探究芥子碱兴奋离体肠管的作用机制，本研究采用M胆碱受体配体结合实验，考察其是否通过M受体通路兴奋肠管平滑肌。图1A，1B显示，芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用可以部分被M受体阻断剂阿托品阻断且芥子碱氯化盐可以拮抗M受体阻断剂阿托品所致的肠管舒张，也就是说M胆碱受体途径参与了芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用。图1C显示，阿托品抑制芥子碱氯化盐兴奋肠管的作用可以被再次加入的芥子碱氯化盐所逆转，这种现象的出现有两种推测，一是芥子碱氯化盐除了可以激动M受体外，还可能通过其他通路实现提高离体肠管张力的作用，二是芥子碱氯化盐与阿托品之间存在着竞争M受体的作用，阿托品剂量低不足以封闭所有肠管上的M受体。针对上述假设本研究采用大剂量阿托品(10%)孵育离体肠管，当阿托品完全阻断M受体后再加入芥子碱氯化盐(图1D)，结果显示，大剂量阿托品使肠管呈现完全松弛状态，但并不能完全阻断芥子碱氯化盐对肠管的兴奋作用，且这种兴奋作用不会被再次加入的大剂量阿托品所竞争性减弱，结合图1C、1D说明阿托品的确与芥子碱氯化盐存在竞争M受体的作用，但除了M胆碱受体途径外还有其他途径参与了芥子碱氯化盐对肠管的兴奋作用，但究竟还有哪些途径参与了芥子碱兴奋离体肠管，仍需要进一步探索。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.Ⅰ部.北京:化学工业出版社，2010.

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