贝母花的定性鉴别及含量测定研究

崔明超，程斌，陈宏降，陈云

(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)

贝母花为百合科植物浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥带茎梢的花［1］，别名浙贝花、象贝花，主产于浙江鄞州、磐安等地。贝母花一般是在3～4月植株最后两朵花开放时采摘干燥，具有止咳化痰之功效。

本文采用TLC对贝母花进行了定性鉴别，ELSDHPLC法进行定量检测贝母素甲和贝母素乙的含量，建立了简便易行、稳定性好的质量控制方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效高效液相色谱仪，Agilent 380蒸发光散射检测器。贝母花药材采自宁波市鄞州区章水镇，经浙江医药高等专科学校杨雄志教授进行品种鉴定。贝母素甲对照品(供含量测定用，批号110750－201110)，贝母素乙对照品(供含量测定用，批号110751－201111)，均由中国食品药品检定研究院提供;乙醇、盐酸、乙酸乙酯、石油醚(60℃ ～90℃)、三氯甲烷、甲醇等试剂(宁波化学试剂有限公司，分析纯或色谱纯;硅胶G板(青岛海洋化工分厂)。

2 定性鉴别

2.1 对照品溶液

取贝母素甲、贝母素乙对照品，加三氯甲烷制成每1mL含贝母素甲、贝母素乙各2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液

取贝母花粉末5g，加乙醇50mL，水浴回流提取2h，提取液置水浴上蒸干，浸膏用2%盐酸15mL溶解，滤过，酸水液用石油醚萃取2次，每次15mL，乙酸乙酯萃取2次，每次15mL，酸水液用氨水调节至pH=10，三氯甲烷萃取1次，15mL，置水浴蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使其溶解，作为供试品溶液。

吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲醇－浓氨试液(17:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。结果在与对照品色谱相同的位置上，各供试品色谱均显相同颜色的斑点(见图1)。

图1 贝母花的薄层色谱鉴别

3 含量测定

贝母素甲和贝母素乙均为贝母花中主要有效成分［2］，且含量较高，化学性质稳定，因此以贝母素甲和贝母素乙为含量测定指标。

3.1 色谱条件

Lichrospher－C18色谱柱(5μm，4.6mm ×150mm);流动相:乙腈 －水 －三乙胺(68∶32∶0.03)，流速:1.0mg/mL;柱温:30℃;进样量:20μL［3］。Agilent 380蒸发光散射检测器条件:漂移管温度:90℃，氮气流速:2.2L/min。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取贝母素甲和贝母素乙的对照品适量，加甲醇制成每 1mL含贝母素甲 1.850mg、贝母素乙1.880mg的混和溶液，作为母液。从中精密量取10mL，甲醇稀释至100mL，制成每1mL含贝母素甲0.185mg、贝母素乙0.188mg的混合溶液，备用。

3.3 供试品溶液制备

取贝母花粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓氨试液5mL，浸润1h，精密加入三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液50mL，称定重量，混匀，加热回流2h，放冷，再称定重量，用三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至1mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得［3］。

3.4 系统适应性考察

精密吸取含贝母素甲0.185mg/mL和贝母素乙0.188mg/mL 对照液 10μL，各供试品溶液 20μL，注入高效液相色谱仪［4］。理论塔板数分别以贝母素甲峰和贝母素乙峰计，均不低于2000，贝母素甲峰与其他相邻峰基线分离，分离度 R＞1.5，保留时间约为9min，贝母素乙峰与其他相邻峰基线分离，分离度R＞1.5，保留时间约为11min(见图2)。

图2 贝母素甲和贝母素乙混合对照品HPLC色谱图

3.5 线性关系考察

精密量取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、9.0mL 含贝母素甲0.185mg/mL和贝母素乙0.188mg/mL混合对照品溶液，定容至10mL量瓶中，摇匀，制成系列溶液［5］。

精密吸取上述6个不同浓度的对照液各10μL，注入高效液相色谱仪，按上述检测条件测定峰面积。分别以贝母素甲和贝母素乙的浓度C(mg/mL)的对数值为横坐标，以贝母素甲和贝母素乙平均峰面积的对数值A为纵坐标进行线性回归，得回归方程:lgA1=1.573lgC1+2.295(r=0.9998)，线性范围 0.0185 ～0.185mg/mL，lgA2=1.545lgC2+2.269(r=0.9997)，线性范围0.0188 ～0.188mg/mL。

3.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL，连续进样6次，以样品中贝母素甲和贝母素乙的总含量计算RSD，RSD=0.691%(n=6)，显示该方法具有良好的精密度［6］。

3.7 稳定性试验

供试液分别于0、2、4、6、8、10h 按上述条件进行测定［7］，结果贝母素甲峰面积值的RSD为0.76%，贝母素乙峰面积值的RSD为0.25%，说明贝母素甲和贝母素乙在10h内稳定。

3.8 专属性试验

在上述条件下，精密吸取贝母花阴性对照液20μL，注入高效液相色谱仪［8］。图谱显示阴性无干扰，表明在贝母花中，贝母素甲和贝母素乙的专属性较强。

3.9 重复性试验

取同一样品(120605)约2g，精密称定6份，按上述方法测定，测得样品中贝母素甲和贝母素乙的总含量，结果RSD=2.25%，显示重复性良好。

3.10 加样回收率试验

取批号为120605的贝母花2g，精密称定6份，分别精密加入浓度为0.373mg/mL的贝母素甲和贝母素乙的混合对照液3.7mL，按上述方法制得供试液并测得样品中贝母素甲和贝母素乙的总含量［9］(见表1)。

表1 贝母素甲和贝母素乙总量加样回收率试验

3.11 样品测定

分别精密吸取对照液10μL，供试液20μL，注入高效液相色谱仪(见图3)。采用外标两点法对数方程计算其含量，测得贝母花中贝母素甲和贝母素乙的总含量平均值为0.136%(见表2)。

表2 样品含量测定结果

4 讨论

图3 贝母花样品液HPLC色谱图

上述实验中，曾参考浙贝母的定性鉴别方法，发现杂质较多，影响薄层展开效果。方法改进后贝母花的鉴别专属性强，重现性好。含量测定中对贝母花中含量较多的贝母素甲和贝母素乙进行了含量测定，从精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收试验结果可以看出，HPLC－ELSD方法重复性好，准确度高，适用于贝母花中生物碱含量的测定。

以上实验表明，贝母花中含有贝母素甲、贝母素乙以及其他生物碱类成分，此类成分已证实为浙贝母中镇咳祛痰的主要成分［10］。笔者所测批次中，贝母花的贝母素甲及贝母素乙的总量高达0.136%，超出《中国药典》(2010版)中浙贝母中对贝母素甲和贝母素乙含量的最低要求(0.080%)，可能为贝母花止咳化痰的物质基础之一。从理论上讲，贝母花有着与浙贝母相近的祛痰效果，但尚需进一步药理及临床实验证实。但姜艳［11］等也发现，浙贝母不同的产地以及不同的规格贝母素甲和贝母素乙的含量相差很大，贝母花是否也存在着产地的差异，还有待于进一步研究。

［1］张贵君.现代中药材商品通鉴［M］.北京:中国中医药出版社，2001:1451.

［2］崔明超.贝母花研究进展［J］.齐鲁药事，2011，30(11):661 －662.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010:274.

［4］崔明超，潘金火.抗感冒颗粒的薄层色谱和含量测定研究［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(9):53 －54.

［5］崔明超，潘金火.清金化痰合剂的薄层鉴别与含量测定［J］.医药导报，2008，27(5):594 －595.

［6］宋娟，潘金火.产后康膏的质量标准研究［J］.时珍国医国药，2008，19(2):366 －367.

［7］赵璧完，朱和平，刘亮镜.归芪益气养血合剂的质量标准研究［J］.现代中药研究与实践，2011，25(4):70－74.

［8］宋广大，袁燕芳.香舒饮分散片的薄层色谱和含量测定研究［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(4):54－55.

［9］赵琰玲，陈春.HPLC－ELSD测定参贝止咳片中的贝母素甲和贝母素乙［J］.华西药学杂志，2013，28(2);202 －204.

［10］李萍，季晖，徐国钧，等.贝母类中药的镇咳祛痰作用研究［J］.中国药科大学学报，1993，24(6):360.

［11］姜艳，李萍.HPLC－ELSD测定浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的含量［J］.中国药学杂志，2005，40(16):1257 －1259.