齐墩果酸对S180荷瘤小鼠细胞色素C和Caspase－3表达的影响

吴勃岩，王雪，董静，刘文波，孙阳，郭艳莹，王晓军

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

细胞凋亡与肿瘤发生发展的关系密切，是近年来肿瘤研究领域的热点，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的重要途径。齐墩果酸(Olesnolic Acid，简称OA)是一种天然产物化学成分，广泛存在于女贞子、白花蛇舌草、夏枯草、乌梅、三七、山茱萸、山楂、丁香、连翘等植物中。齐墩果酸具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫双向调解、抑瘤、促凋亡等多种药理作用［1－3］。本文研究齐墩果酸对肉瘤S180荷瘤小鼠线粒体凋亡途径中相关蛋白细胞色素C和Caspase－3表达的影响，探讨其抗肿瘤作用机制，为齐墩果酸用于临床治疗肿瘤奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，6～8周龄，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物、瘤株和试剂

齐墩果酸(Sigma公司);小鼠S180腹水瘤株(购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院);细胞色素C和Caspase－3试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

2 实验方法

2.1 复制肿瘤动物模型

在无菌的条件下取传代后7天生长良好的S180腹水瘤株，用无菌生理盐水按1∶3稀释，以0.2ml/只接种于小鼠右侧腋下，待其长为实体瘤，阳性率为100%。

2.2 检测肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3蛋白含量

将接种S180肿瘤细胞的小鼠随机分为模型组，齐墩果酸高、中、低剂量组，环磷酰胺组。于接种瘤细胞6h后首次给药，齐墩果酸高、中、低剂量组分别按4.992mg/kg、2.496mg/kg、1.248mg/kg 灌胃给药，环磷酰胺(CY)组40mg/kg腹腔注射，肿瘤模型组以生理盐水0.2ml/只灌胃，连续给药8天，每日1次。断髓处死小鼠，剥离瘤组织，10%甲醛固定，选用免疫组化法常规制片，检测细胞色素C和Caspase－3蛋白含量(按试剂盒说明书步骤操作)。利用Motic Images Advanced 3.2分析软件对各组肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3蛋白阳性细胞平均光密度值进行分析。统计数据结果以(均数±标准差)表示，以SPSS 17.0软件处理，采用t检验。

3 结果

齐墩果酸能上调S180荷瘤小鼠肿瘤细胞内细胞色素C的释放和Caspase－3蛋白的表达。经免疫组化法染色后观察肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3的表达，阳性反应均定位于胞膜和胞浆内(棕黄色或棕褐色颗粒)。通过10×40高倍镜下观察标本，每张切片随机选取五个视野，选取视野内的所有阳性颗粒，并利用分析软件对各肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3阳性细胞平均光密度值进行分析。与模型组比较，给药组的细胞色素C平均光密度值有所升高，齐墩果酸高剂量组和齐墩果酸中剂量组与模型组比较差异极显著(P＜0.01);低剂量组与模型组比较存在显著差异(P＜0.05)。与模型组比较，给药组的Caspase－3平均光密度值均有所升高，齐墩果酸高、中、低三个剂量组与模型组比较差异极显著(P＜0.01)，结果见表1。

表1 齐墩果酸对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3表达的影响(s)

表1 齐墩果酸对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中细胞色素C和Caspase－3表达的影响(s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

10 0.1495 ±0.02048 0.1188 ±0.01246 CY组 40 10 0.2181 ±0.01831＊＊ 0.2384±0.01133＊＊OA高剂量组 4.992 10 0.2076±0.00930＊＊ 0.2250±0.01788＊＊OA中剂量组 2.496 10 0.1727±0.01385＊＊ 0.1862±0.02380＊＊OA 低剂量组 1.248 10 0.1659 ±0.01267* 0.1572 ±0.02180平均光密度值细胞色素C Cspase－3模型组 —组别 给药量(mg/kg)n＊＊

4 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡是近年来肿瘤研究的热点之一。细胞凋亡是机体清除突变和受损细胞的主要机制，凋亡过程的启动与实施受多种分子的调控，这些关键分子的异常表达和功能改变与肿瘤的发生发展密切相关，通过控制凋亡途径中的关键蛋白或酶类的表达或功能，诱导肿瘤细胞凋亡，已成为肿瘤治疗中颇具吸引力的分子靶点。抑癌基因p53能激活线粒体介导的细胞凋亡途径，p53 通过下调 Bcl－2 蛋白［4－5］，上调Bax蛋白而诱导细胞凋亡;p53也可以诱导细胞色素C及Caspase蛋白的释放，促进细胞凋亡。

哺乳动物细胞程序性死亡的主要路径是由线粒体介导的内源性细胞凋亡通路，线粒体不仅是为真核细胞代谢提供能量的工厂，还是细胞凋亡的主要调控中心。细胞色素C在细胞凋亡中起开关作用，是线粒体电子传递链中的一员。线粒体在受到凋亡信号刺激时，会释放出促凋亡因子如细胞色素C到细胞浆中，与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf－1)结合并激活，继而引发Caspase家族的级联激活，切割细胞结构蛋白，发生细胞凋亡。

Caspase家族在凋亡程序中起到执行者的作用，一旦被激活，细胞凋亡将不可避免的进行下去，上游的Caspase就能顺次激活下游的Caspase，形成Caspase级联反应，将凋亡信号一级级传递至凋亡底物，完成细胞凋亡过程。Caspase家族在介导细胞凋亡途径的过程中具有非常重要的作用，是细胞凋亡的中心环节，而Caspase－3是细胞凋亡最为关键的执行分子，在各种因素诱导的凋亡程序中起最后的枢纽作用，是细胞凋亡中的关键蛋白酶。Caspase还能够降解细胞凋亡抑制因子，如Bcl－2等。Caspase水解Bcl－2家族，在除去抗凋亡因子的同时还可以激活促凋亡因子，加速凋亡的进程，因此Caspase家族在细胞凋亡中处于中心地位。免疫组化结果提示，齐墩果酸能促进S180荷瘤小鼠肿瘤细胞内细胞色素C的释放和Caspase－3蛋白的表达，从而实现诱导肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤的作用，其机制可能与线粒体通路有关。

［1］王奇，芦柏震.齐墩果酸的研究进展［J］.中国药房，2008，19(9):711－712.

［2］吴勃岩.女贞子有效成分齐墩果酸对S180荷瘤小鼠抑瘤作用及存活时间的影响［J］.中医药信息，2010，27(1):37 －38.

［3］董静，李明珠，吴勃岩.原位末端标记法检测齐墩果酸诱导细胞凋亡的实验研究［J］.中医药信息，2013，30(3):134 －135.

［4］吴勃岩.齐墩果酸对肉瘤S－180荷瘤小鼠细胞凋亡相关基因表达的影响［J］.中医药信息，2011，28(6):34 －35.

［5］吴勃岩，董静，高明，等.齐墩果酸对S180荷瘤小鼠P53蛋白表达及 TNF－α 的影响［J］.国际遗传学杂志，2010，33(4):63－64.