激活PPARα表达对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大及 NFATc4与p65-NFκB相互作用的影响*

邹 剑， 周后凤， 先志伟， 刘培庆

(1成都市第五人民医院药剂科，四川 成都 611130; 2中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东 广州 510006)

左心室肥厚是原发性高血压最常见的器官损伤性疾病，是心脏对压力负荷和神经体液因素改变的代偿性反应。心肌肥厚不仅仅是心力衰竭前期的一种适应性反应，也是心肌缺血、心律失常和猝死等心血管疾病的独立危险因素[1]。导致病理性心肌肥厚的主要因素包括基因多态性、高血压、缺血性损伤导致的心肌细胞死亡、心肌代谢改变等[2]。心肌肥厚和心力衰竭是众多心血管疾病的严重和终末阶段，研究其信号转导机制具有非常重要的意义。

过氧化物酶体增殖物激活受体 α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)激动剂非诺贝特(fenofibrate)可通过多种信号途径调控心肌肥大[3-4]。我们近期研究发现激活PPARα后可促进心肌细胞核内PPARα与活化T细胞核因子胞浆型4(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 4, NFATc4)之间的相互结合，抑制NFATc4与GATA 4之间的相互作用，进而抑制NFATc4在肥大基因脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)启动子上的DNA结合活性，而沉默PPARα后可取消上述效应[5]。钙调磷酸酶/NFATc4信号通路是调控心肌肥大的关键环节[6]。NFATc4是病理性心肌肥大的重要转录调控因子，过表达构成性激活的NFATc4突变蛋白可诱导心肌肥大的发生；而过表达显性负突变的NFATc4蛋白可抑制内皮素1(endothelin-1，ET-1)、苯肾上腺素(phenylephrine,PE)或血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大[7]。近年来，炎症反应在心肌肥大中的作用受到广泛关注。Kawano等[8]发现在ET-1、PE或AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，NF-κB的表达明显上调，而抑制NF-κB能明显减少肥大反应。大量的研究结果证实，转录因子NFATc4和NF-κB在病理性心肌肥大的发病过程中均发挥重要的调控作用，它们在结构中均有Rel同源结构域(Rel homology domain，RHD)，这是蛋白质之间相互作用的结构基础。因此，我们推测两者在心肌细胞内可能存在相互作用，并有可能形成转录复合体参与对心肌肥大的调控。本文重点研究核受体PPARα与核转录因子NFATc4、NF-κB在心肌肥大中的相互作用及信号联系，为进一步探索心肌肥大的发病机制和治疗靶点提供新的实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠PPARα的单克隆抗体(P0869)和非诺贝特(F6020)购自Sigma；NFATc4 (sc-13036)和p-NFATc4(sc-68710)抗体购自Santa Cruz；p65(ab7970-1)抗体购自Abcam；ECL化学发光检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce。

2 方法

2.1乳鼠心肌细胞培养 取1～2 d SD乳鼠，用胰蛋白酶消化法(置冰上消化20 min后，37 ℃水浴中多次消化)将乳鼠左心室消化成单细胞悬液，在差速贴壁分离后，调节细胞密度至5×105/L接种于培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，并加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纤维细胞生长。在培养48 h后更换为无血清培养基并加入试剂，用于后续实验。

2.2Real-time PCR 按照Trizol说明书步骤提取细胞总RNA，利用紫外分光光度仪测定RNA浓度与纯度。参照TaKaRa有限公司逆转录PCR试剂盒说明书进行逆转录反应。采用两步法进行PCR扩增，分别加入荧光染料、引物序列和逆转录产物后在real-time PCR仪中进行反应。参数设置: 30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。引物由上海生工设计合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.3免疫共沉淀及Western blotting 按照Active Motif核蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞核蛋白，将核蛋白(200 μg)与抗体或琼脂糖珠混合置4 ℃，缓慢摇摆过夜。琼脂糖珠经缓冲液洗涤，提取蛋白进行Western blotting。SDS-PAGE蛋白电泳，转膜，将PVDF膜置于5% BSA封闭液中室温封闭1 h后加入Ⅰ抗，孵育过夜。用TBST洗膜后加入Ⅱ抗并在室温孵育1 h。加入ECL试剂，曝光，显影，定影。

2.4电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA) 按照Pierce的EMSA试剂盒说明书，配制非变性PAGE胶，准备核蛋白的结合反应，依次加入Poly(dI:dC)、核蛋白和生物素标记的探针，室温放置20 min。4 ℃、100 V，电泳70～80 min，直至溴酚蓝迁移到胶长的2/3 或3/4处，转膜。将膜置于254 nm紫外灯下交联10～15 min。每张膜加入10 mL封闭液，室温封闭60 min，然后加入稳定的链亲和素-辣根过氧化物酶交联物(SA-HRP)，曝光，显影，定影。

3 统计学处理

数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，用SPSS 17.0统计软件分析，组间均数比较采用单因素方差分析。采用GraphPad Prism 5.0软件作图，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 非诺贝特抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大

原代培养的心肌细胞先用非诺贝特(10 μmol/L)预处理1 h后，再加入100 nmol/L的AngⅡ处理24 h。AngⅡ刺激24 h后，肥大标志物心房钠尿因子(atrial natriuretic factor,ANF)、BNP和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)mRNA水平升高，心肌细胞表面积也明显增加。非诺贝特预处理能明显抑制AngⅡ诱导的ANF、BNP和β-MHC mRNA水平增高，以及心肌细胞表面积的增加，见图1。

Figure 1. Effects of fenofibrate (Feno) on the cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ. A: the mRNA levels of atrial natriuretic factor (ANF), brain natriuretic peptide (BNP) and β-myosin heavy chain (β-MHC) detected by real-time PCR; B: the cell surface area detected by rhodamine-phalloidin and DAPI staining (×500). Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ.

2 非诺贝特抑制AngⅡ诱导的NFATc4与p65-NFκB的核转位以及两者之间的相互作用

如图2A所示，AngⅡ(100 nmol/L)处理6 h后，NFATc4与p65-NFκB的入核明显增加；而用非诺贝特预处理后能明显抑制NFATc4与p65-NFκB的核转位。如图2B所示，AngⅡ(100 nmol/L) 刺激明显增强心肌细胞核内NFATc4与p65-NFκB之间的相互结合；而用非诺贝特预处理后，两者之间的相互作用明显减弱。这表明非诺贝特抑制转录因子NFATc4和p65-NFκB的转位入核，以及两者在心肌细胞核内的相互作用，可能是其抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的重要机制。

Figure 2. The effects of fenofibrate (Feno) on the nuclear translocations (A) and interaction (B) of NFATc4 and p65 induced by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AngⅡ.

3 干预p65-NFκB对心肌细胞核内NFATc4与PPARα或p65-NFκB相互作用的影响

如图3A、B所示，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)能明显增加心肌细胞核内p65-NFκB的表达，而二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)可明显减少心肌细胞核内p65-NFκB的表达。PDTC能明显抑制由AngⅡ引起的NFATc4与p65-NFκB间的相互作用，而TNF-α可取消非诺贝特对AngⅡ诱导的PPARα与NFATc4，以及NFATc4与p65-NFκB之间相互 作用的影响，见图3C、D。

Figure 3. Effects of activation or inhibition of NF-κB on the interaction of NFATc4 with PPARα or p65-NFκB. The cardiomyocytes were treated with 0～20 μg/L TNF-α (A) or 0～100 μmol/L PDTC (B) for 6 h, and the nuclear protein expression of p65-NFκB was detected by Western blotting. Furthermore, the cardiomyocytes were pretreated with or without fenofibrate (Feno, 10 μmol/L), TNF-α (20 μg/L) and/or PDTC (100 μmol/L) for 1 h followed by AngⅡ (100 nmol/L) stimulation for 24 h, and the interactions of NFATc4 with PPARα (C) and NFATc4 with p65-NFκB (D) in the nucleus were determined by co-immunoprecipitation. *P<0.05,**P<0.01 vs control (no treatment); #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡ and Feno.

4 非诺贝特对AngⅡ诱导的NFATc4在BNP启动子上DNA结合活性的影响

研究表明，NFATc4可以直接结合在肥大相关基因的启动子，调控肥大基因的表达[9]。我们在大鼠BNP启动子上-330/-351区间发现有一个可疑的NFATc4的保守结合序列，我们依此设计了一条探针，并在3’端标记了生物素。如图4所示，AngⅡ可显著增强NFATc4在BNP启动子上的DNA结合活性；用非诺贝特或PDTC预处理1 h可明显减弱AngⅡ诱导的NFATc4 DNA结合活性的增强;非诺贝特对AngⅡ诱导的NFATc4 DNA结合活性的抑制作用可被TNF-α所取消。

Figure 4. Effects of PPARα activation on NFATc4 binding to BNP promoter in the cardiomyocytes stimulated by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡand fenofibrate (Feno).

讨 论

我们发现PPARα激动剂非诺贝特在体外能够显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。给予非诺贝特后，心肌细胞核内PPARα与NFATc4之间的相互作用明显增强，同时伴随着NFATc4与p65-NFκB之间相互作用的减弱，进而抑制了NFATc4在BNP启动子上的DNA结合活性以及肥大标志物的表达。此外，我们还发现非诺贝特的上述效应可被对NF-κB具有较强激动作用的TNF-α取消。这些实验结果有助于进一步理解非诺贝特抗心肌肥大作用的机制，并为通过干预转录因子相互作用从而防治心肌肥大提供了初步的实验依据。

研究表明，NF-κB参与了病理性心肌肥大的分子调控[10-11]。在静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，主要存在于胞浆中。当IκB被磷酸化降解后，NF-κB可快速入核并引起心肌肥大[8，12]。NFATc4和NF-κB在其结构中均包含RHD同源结构域，这是蛋白质之间相互作用的结构基础[13]。AngⅡ被广泛用于体外心肌肥大的机制研究，AngⅡ刺激可以激活NFATc4和NF-κB信号通路[14-15]。我们发现AngⅡ刺激能够明显增强NFATc4与p65-NFκB从胞浆向胞核的转移，并增强心肌细胞核内NFATc4与p65-NFκB的相互作用，同时伴随着肥大标志物ANF、BNP和β-MHC mRNA表达明显上调。用非诺贝特预处理后可明显抑制AngⅡ诱导的NFATc4与p65-NFκB的核转位和心肌细胞核内NFATc4与p65-NFκB之间的相互作用，以及肥大标志物的表达。这表明NFATc4与p65-NFκB之间的相互作用在心肌肥大的信号调控中发挥了重要作用。

我们发现非诺贝特预处理可显著抑制AngⅡ诱导的NFATc4在BNP启动子上的结合活性，并降低BNP mRNA和蛋白表达水平。为进一步证实PPARα对NFATc4转录活性的影响是否与NFATc4与p65-NFκB之间的相互作用有关，我们采用对NF-κB具有较强激动作用的TNF-α[13-14]和抑制剂PDTC[15]对心肌细胞进行预处理。Western blotting结果显示，TNF-α明显增加心肌细胞核内p65-NFκB的蛋白表达，而PDTC则显著抑制p65-NFκB在细胞核内的表达。此外，我们发现TNF-α明显增强心肌细胞核内NFATc4/p65-NFκB之间的相互作用，并减弱非诺贝特诱导的NFATc4/PPARα之间相互作用，逆转非诺贝特对AngⅡ诱导的NFATc4转录活性的抑制作用。而PDTC预处理后，可显著抑制AngⅡ诱导的NFATc4/p65-NFκB之间的相互作用以及NFATc4在BNP启动子上DNA结合活性的增加。

综上所述，在AngⅡ的作用下，NFATc4去磷酸化转位入核，在细胞核内NFATc4与p65-NFκB发生相互作用形成转录复合体并结合到靶基因BNP启动子上，启动BNP的转录，最终导致心肌肥大的发生。非诺贝特预处理激活PPARα后，活化的PPARα进入细胞核内并与NFATc4发生相互作用，这种相互作用可以抑制NFATc4/p65-NFκB转录复合体的形成，阻止NFATc4结合到BNP启动子序列上，抑制BNP的转录，进而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

[参 考 文 献]

[1] Rajabi M, Kassiotis C, Razeghi P, et al. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis[J]. Heart Fail Rev, 2007, 12(3-4):331-343.

[2] Levy D, Garrison RJ, Savage DD, et al. Prognostic implications of echocardiographically determined left ventricular mass in the Framingham Heart Study [J]. N Engl J Med, 1990, 322(22):1561-1566.

[3] Irukayama-Tomobe Y, Miyauchi T, Sakai S, et al. Endothelin-1-induced cardiac hypertrophy is inhibited by activation of peroxisome proliferator-activated receptor-α partly via blockade of c-Jun NH2-terminal kinase pathway[J]. Circulation, 2004, 109(7):904-910.

[4] 李瑞芳, 乐 康, 高 洁, 等. 抑制PPAR-α表达对ET-1诱导的心肌肥大和PI3K/Akt/GSK3β-NFATc4通路的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2009, 25(12):2289-2294.

[5] Le K, Li R, Xu S, et al. PPAR-α activation inhibits endothelin-1-induced cardiomyocyte hypertrophy by prevention of NFATc4 binding to GATA-4[J]. Arch Biochem Biophy, 2012, 518(1):71-78.

[6] Van RE, Doevendans PA, Babiker FA, et al. Requirement of nuclear factor of activated T-cells in calcineurin-mediated cardiomyocyte hypertrophy[J]. J Biol Chem, 2002, 277(50):48617-48626.

[7] Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy[J]. Cell, 1998, 93(2):215-228.

[8] Kawano S, Kubota T, Monden Y, et al. Blockade of NF-kappaB ameliorates myocardial hypertrophy in response to chronic infusion of angiotensin II[J]. Cardiovasc Res, 2005, 67(4):689-698.

[9] Hottelart C, Esper N, Rose F, et al. Fenofibrate increases creatininemia by increasing metabolic production of creatinine[J]. Nephron, 2002, 92(3):536-541.

[10] Perkins ND. Post-translational modifications regulating the activity and function of the nuclear factor kappa B pathway[J]. Oncogene, 2006, 25(51):6717-6730.

[11] Hirotani S, Otsu K, Nishida K, et al. Involvement of nuclear factor-kappaB and apoptosis signal-regulating kinase 1 in G-protein-coupled receptor agonist-induced cardiomyocyte hypertrophy[J]. Circulation, 2002, 105(4):509-515.

[12] Lunde IG, Kvaloy H, Austbo B, et al. Angiotensin II and norepinephrine activate specific calcineurin-dependent NFAT transcription factor isoforms in cardiomyocytes[J]. J Appl Physiol, 2011, 111(5):1278-1289.

[13] Li H, Lin X. Positive and negative signaling components involved in TNFα-induced NF-κB activation [J]. Cytokine, 2008, 41(1):1-8.

[14] Cho KH, Shin SY, Lee HW, et al. Investigations into the analysis and modeling of the TNFα-mediated NF-κB-signaling pathway[J]. Genome Res, 2003, 13(11): 2413-2422.

[15] Liu Q, Chen Y, Auger MM, et al. Interaction between NFκB and NFAT coordinates cardiac hypertrophy and pathological remodeling [J]. Circ Res, 2012, 110(8):1077-1086.