利用CODEHOP设计简并引物克隆红色红曲霉丝氨酸羧肽酶基因片段和序列分析*

齐育平， 周月婷， 马泽萍， 陈丹凤， 蒋冬花

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

羧肽酶(carboxypeptidases，CPs)是一类肽链外切酶，能专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸，在人类、动物、植物的不同组织器官中发挥着重要的生理功能[1].丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase，SCP)又称酸性羧肽酶，是一个庞大的水解酶家族，亚基相对分子质量为40 000～75 000，广泛存在于真菌[2-3]、高等植物[4]和动物组织[5]中，在酸性环境下具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，可同时参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解[6].

丝氨酸羧肽酶在植物生长发育过程中参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节，并且在许多生化途径,包括次生代谢产物的生物合成、催化酰基转移、除草剂共轭和种子萌发等相关蛋白质降解中起重要作用[7].动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等的胰脏中，如羧肽酶A/B(carboxypeptidase A/B)，其数量非常有限,价格昂贵,导致其应用受到限制；微生物来源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中，具有广阔的应用前景.因此，借助基因工程策略、采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶，有望克服羧肽酶生产过程中遇到的动植物原料来源有限等限制，进一步降低生产成本、提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围.

本文采用CODEHOP(Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)[8]在线软件程序化设计简并引物[9-12]，通过逆转录-聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)的方法克隆了红曲菌的丝氨酸羧肽酶基因片段，为后续的研究打下基础.

1 材料和方法

1.1 主要数据库与软件

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/);Blockemaker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html);CODEHOP(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html);primer premier 6.0.

1.2 菌株与质粒

红色红曲霉(Monascusruber)由本微生物实验室保存.大肠杆菌为DH5α，质粒为Takara pMD18-T Vector.

1.3 酶和试剂盒

RNA提取试剂盒为Omega的E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit试剂盒，回收试剂盒为Omega的D2500-01Gel Extraction Kit;反转录酶用Promega的M-MLV Reverse Transcriptase;Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、连接酶及引物等均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品.

1.4 简并引物设计和筛选

1)查找氨基酸序列.从数据库NCBI中搜索丝氨酸羧肽酶基因的氨基酸序列，选取了曲霉属(Aspergillus)中具有代表性的如下6个种的序列：红曲霉Aspergillusniger(GeneBank登录号：CAA56075)、烟曲霉Aspergillusfumigatus(GeneBank登录号：XP_752099)、米曲霉Aspergillusoryzae(GeneBank登录号：EIT73689)、白曲霉Aspergilluskawachii(GeneBank登录号：GAA91222)、海枣曲霉Aspergillusphoenicis(GeneBank登录号：BAA04974)和宇佐美曲霉Aspergillususamii(GeneBank登录号：AFO66605).

2)Block比对.参照文献[13]的方法进行Block比对.登录Blockmaker，对上述6个序列进行Block比对，得到3个高度保守的连续氨基酸区域.

3)CODEHOP引物搜索.Block比对后,从Block results界面登录CODEHOP数据库进行引物搜索.搜索主要参数设定为：简并度64，退火温度为60 ℃，遗传密码为standard，密码子选用框的备选项没有目标物种，则选用与目标物种亲缘关系较近的物种构巢曲霉(Aspergillusnidulans).

4)选取合适的上下游引物.原则：①上下游引物之间的退火温度相差不超过2 ℃；②简并度控制在64以下；③上下游引物的位置不能相差太远，产物长度控制在1 000 bp以下.

5)利用primer premier 6.0进行引物分析.引物不能含有牢固的自身互补序列；避免上下游引物之间互补形成引物二聚体；避免4个以上的连续单一碱基和同源碱基.

1.5 总RNA提取及RT-PCR扩增

将本实验室保存的红色红曲霉活化后接到马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)平板上，28 ℃培养15 d，收集菌丝，参照Omega试剂盒提供的方法提取红色红曲霉的总RNA，分别以5-oligo和3-CDS为上下游引物反转录合成cDNA,再以设计好的引物进行RT-PCR扩增.PCR程序采用降落PCR(Touchdown PCR)：退火温度从65 ℃降到55 ℃，每循环下降0.5 ℃，一共20个循环；再进行常规程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；循环次数为35，最后72 ℃延伸10 min.

1.6 RT-PCR产物检测、克隆与测序

制1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Omega D2500-01Gel Extraction Kit试剂盒回收目标片段，将回收的片段与pMD18-T Vector连接，热激法转化至感受态大肠杆菌DH5α，克隆过程参照Takara pMD18-T Vector试剂盒说明书.经筛选获得的阳性克隆产物送交上海生物工程技术服务有限公司测序.

1.7 PCR产物分析

应用MEGA软件进行序列分析和进化树的建立；核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI数据库的BLASTN和BLASTX完成.

2 结果与分析

2.1 简并引物筛选及cDNA引物

经CODEHOP检索及适当筛选，最终选取一对简并引物用于本实验.上游简并引物(Forward)、下游简并引物(Reverse)及合成cDNA的引物5-oligo和3-CDS的序列见表1.

表1 引物序列

2.2 红色红曲霉培养及总RNA检测结果

红色红曲霉活化后接到PDA平板上，28 ℃培养15 d得菌落见图1(a),收集菌丝体用于总RNA的提取.提取的红色红曲霉总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1(b):总RNA 的18S rRNA，28S rRNA和5S rRNA这3条带非常清晰;28S rRNA和18S rRNA这2条带非常亮，且28S rRNA的亮度大约为18S rRNA的2倍，5S rRNA条带相对较暗,说明提取的RNA质量较高.

图1 红色红曲霉PDA平板培养15 d的菌落及总RNA凝胶电泳检测结果

2.3 RT-PCR结果

M：DL2000 Mark;1:RT-PCR产物图2 简并引物RT-PCR产物电泳结果

利用表1中的简并引物进行降落PCR，扩增出特异的条带，片段大小与预测结果基本一致.由琼脂糖电泳检测结果(见图2)可见，引物的特异性较好，基本没有非特异性条带.小于100 bp的条带为引物二聚体.

2.4 测序结果

将目的条带割胶回收，经连接转化后，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，最终得到一条348 bp的丝氨酸羧肽酶基因片段，其序列见图3.

2.5 基因片段序列同源性分析

将如上测序结果以BLASTN进行核酸比对，结果显示丝氨酸羧肽酶基因分布较广，且该基因片段与GenBank数据库中多个菌株的丝氨酸羧肽酶基因序列的同源性较高.同时,挑选不同物种的丝氨酸羧肽酶基因序列，使用MEGA5软件中的Bootstrap Test of Phylogeny和Neighbor-Joining法构建丝氨酸羧肽酶基因系统进化树(见图4)，直观地显示出它们的亲缘关系.

图3 红色红曲霉丝氨酸羧肽酶(SCP)基因片段序列

再将该序列进行BLASTX检索氨基酸序列的相似性，结果如表2所示.

由表2可知，克隆的红色红曲霉DNA所编码的氨基酸序列与丝氨酸羧肽酶有高度的相似性，其中：与黄曲霉(Aspergillusflavus)的丝氨酸羧肽酶序列比对后总得分为157，同源性达到73%；与白曲霉(Aspergilluskawachii)和黑曲霉(Aspergillusniger)的丝氨酸羧肽酶序列同源性也分别达到了58%和59%.说明所克隆的DNA 为丝氨酸羧肽酶序列.

本实验用CODEHOP设计的简并引物，再结合降落PCR和高引物浓度,能较好地扩增目的片段，减少非特异片段的扩增.

图4 红色红曲霉丝氨酸羧肽酶(SCP)基因部分序列的系统发育树

表2 用BLASTX检索GeneBank的同源性结果

3 结论与讨论

利用遗传密码的简并性设计简并引物是克隆蛋白质家族cDNA和基因组DNA的常规方法.但由于简并性问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率过低，PCR产物特异性不高.虽然可以通过减少简并引物长度相对降低简并性，但是由于引物的解链温度(Tm值)过低，PCR假阳性率也会相对提高，有时不得不设计第3条引物对PCR产物进行二次巢式PCR扩增[14-17].

与通常设计的简并引物不同，CODEHOP所设计的引物由2部分构成：5′端非简并的“夹板”区(clamp)和3′端的简并“核心”区(core).前者主要考虑到引物的退火温度，通常其长度为20～30个碱基;后者则是利用约4个高度保守的氨基酸来设计简并引物.在PCR体系中，这一引物的杂合结构(5′端的共同区与3′端的简并区)在扩增早期对源DNA有较好的特异性，而在扩增后期对于PCR合成产物有着较高的选择性.与标准简并PCR相比，在扩增早期，二者与模板DNA的结合效率都是一致的;在扩增后期，标准简并PCR中与PCR产物结合的是大多数引物，而在CODEHOP简并PCR中，其所有的引物都能与早期PCR产物相结合，从而大大提高了扩增效率.总体来看，CODEHOP程序最大程度地预测了保守性氨基酸的编码序列，既减少了引物的简并度，又保证了PCR产物的特异性[17]，对于克隆未知基因家族片段不失为一种高效简便的方法.

本实验利用工具软件Block Maker及CODEHOP等程序化设计软件设计出丝氨酸羧肽酶基因部分序列的简并引物，以反转录合成的cDNA为模版，采用降落PCR技术,成功地克隆出红色红曲霉中丝氨酸羧肽酶基因的部分序列.该DNA片段的成功克隆证实了丝氨酸羧肽酶在相近种属间的同源性，也为进一步研究红曲霉中的羧肽酶提供了参考.

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