胰腺癌相关抗原MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究

陈江 郭晓钟 李宏宇 邵晓东 王迪 赵佳钧 许文达

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，临床预后极差[1]，治疗十分棘手，迫切需要探索新的有效的治疗手段。树突细胞(dendritic cells, DC)是体内功能最为强大的抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APS)，能够刺激并致敏T淋巴细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lynphocytes, CTL )，启动机体免疫应答。以DC为基础构建的肿瘤疫苗对多型肿瘤均有显著的免疫治疗作用，已成为当前肿瘤生物免疫治疗的研究热点之一[2-4]。本研究将胰腺癌相关抗原MUC1、survivin mRNA联合转染DC，观察其在体外诱导并激发抗原特异性CTL的能力，为今后胰腺癌多表位抗原DC疫苗的开发和临床应用奠定基础。

材料与方法

一、临床病例及试剂

筛选2012年6月至2013年6月期间沈阳军区总医院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，其中男性4例，女性2例，年龄35～65岁，平均年龄50岁。全部患者均经组织病理学检查(剖腹探查活检4例，细针穿刺活检2例)证实为胰腺癌。入选前未经放、化疗及免疫治疗。试验经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2由沈阳军区总医院消化科实验室保存。RPMI-1640、小牛血清购自Hyclone公司，rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α购自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86单抗购自Santa-Cruz公司，Trizol、 MTT、DMSO、Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma公司，3H标记甲基胸腺嘧啶(3H-TdR)由中科院原子能所提供，IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ细胞因子检测试剂盒购自BD公司，sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit购自Qiagen公司。

二、DC的分离、培养、鉴定

参照文献[5]方法，通过Ficoll密度梯度离心法分离来自胰腺癌患者100 ml外周血中的单核细胞(PBMC)，贴壁生长1 h后，取出未贴壁细胞备用。贴壁细胞继续培养20 h，更换新鲜培养液，加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)，继续培养5 d后加入TNF-α (10 ng/ml)，使用倒置显微镜连续观察体外培养5～10 d的DC形态学变化。收集成熟DC(大部分细胞培养至7 d即可呈现成熟DC形态特征)，用流式细胞仪分析DC的特征性标志CD40、DC特征性成熟标志CD83、共刺激分子CD86以及MHC类分子HLA-DR等的表达水平。

三、MUC1、survivin mRNA扩增及DCs的转染

人胰腺癌MiaPaCa-2细胞常规培养、传代。取对数生长期细胞，应用Trizol抽提细胞总RMA。采用Primer premier 5.0软件设计MUC1、survivin及作为内参的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase, HPRT)引物，并经Gene bank验证。MUC1引物上游为5′-TGAGTGATGTGC-3′，下游为5′-CTGCCCGTAGTTCTTTCG-3′，扩增产物158 bp；survivin引物上游为5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′，下游为5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，扩增产物171 bp；HPRT引物上游为5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′，下游为5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′，扩增产物221 bp。先逆转录成cDNA，再按照T7 mMessage mMachine试剂盒说明书于37℃ 2～4 h体外转录、扩增MUC1和survivin mRNA，沉淀后保存。参考文献[6]的方法，取200 μl DC细胞悬液加入2 mm的电极杯，分别加入20 μg MUC1、survivin mRNA及联合加入MUC1、survivin mRNA。采用电压300 V，间隔125 ms，4个脉冲，持续250 ms的参数行电穿孔转染，电穿孔后立刻将电极杯置入4℃冰箱静置10 min，移入加有完全培养基的12孔培养板中常规培养0～96 h，3组DC分别命名为DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1+survivin。

四、转染DC的MUC1、survivin mRNA表达检测

分别收集3组转染DC，用Trizol提取总RNA，采用实时定量PCR法检测MUC1、survivin mRNA表达，按照QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒说明书操作。PCR反应条件：95℃ 15 min，94℃ 20 s， 60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40个循环，最后68℃ 60 s中止反应。以未转染DC作为对照组。根据文献[7]的方法，用双标准曲线法相对定量MUC1、survivin mRNA的表达量。mRNA相对表达量=转染DC的目的基因与内参基因的浓度比值/未转染DC的目的基因与内参基因浓度比值。每个样品重复2次，取均值。同时，使用MTT法检测DC的存活率。

五、转染DC刺激自体T淋巴细胞的增殖实验

分别收集3组转染DC作为刺激细胞，调节细胞密度为1×105/ml；收集患者自体PBMC中的T淋巴细胞作为效应细胞，调节细胞密度为1×106/ml。按刺激与效应细胞1∶10、1∶20、1∶40和1∶80比例加入到96孔板中，终体积200 μl，常规培养5 d。以RPMI-1640培养基替代效应细胞作为对照组。收获细胞前18 h加入3H-TdR，每孔1 μCi。使用液闪烁仪检测每分钟脉冲数，表示为增殖指数。每个样本设4个复孔，取均值。

六、转染DC激发抗原特异性CTL释放的Th1型细胞因子IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ的检测

以上述刺激与效应细胞按1∶10比例混合反应14 d，以未转染DC与患者自体T淋巴细胞反应组作为对照。应用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ水平，按试剂盒说明书操作。每个样本设2个复孔，取均值。

七、统计学处理

结 果

一、DC的分离、培养和鉴定

经体外分离、培养，DC数量可达初始数量的10～15倍。镜下见胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起，部分突起末端呈球状膨大(图1)。成熟DC的表面标志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86呈阳性表达，阳性表达率分别为34.31%、50.21%、89.17%和73.62%(图2)。

二、转染DC的MUC1、survivin mRNA表达

DC-MUC1的MUC1 mRNA表达量为36.24±5.17；DC-survivin的survivin mRNA表达量为34.53±4.02；DC-MUC1+survivin的MUC1、survivin mRNA表达量分别为31.79±4.26和14.67±2.96，较DC-MUC1及DC-survivin的表达量显著下降，差异有统计学意义(t值分别为4.41、9.68，P值均<0.05)。

图1 体外培养的胰腺癌患者外周血DC细胞形态学表现(左：GIMSA染色 ×200；右：扫描电镜 ×2 μm)

图2 体外培养的胰腺癌患者外周血DC细胞表面标志物的表达

三、转染DC的存活率

DC-MUC1及DC-survivin的存活率稳定在80%左右，无明显变化；DC-MUC1+survivin的存活率呈时间依赖性下降，96 h时的存活率降至50.21%，显著低于DC-MUC1、DC-survivin，差异有统计学意义(t值分别为3.24、2.97，P值均<0.05，图3)。

四、转染DC刺激自体T淋巴细胞增殖的变化

当DC与T淋巴细胞混合比例为1∶10、1∶20时，DC-MUC1+survivin刺激自体T淋巴细胞的增殖指数显著高于DC-MUC1及DC-survivin，差异有统计学意义(P值均<0.05)；而当混合比例为1∶40、1∶80时，增殖指数的差异无统计学意义(表1)。

图3 单独及联合转染的DCs存活率变化

五、转染DC体外激发抗原特异性CTL释放细胞因子的变化

当DC与T细胞混合比例为1∶10时孵育14 d，DC-MUC1培养上清中IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ水平分别为(892.73±32.90)、(436.51±24.16)、(501.62±12.30)、(981.50±47.82)pg/ml；DC-survivin为(713.62±56.37)、(198.29±22.38)、(203.84±12.55)、(696.05±41.66)pg/ml；DC-MUC1+survivin为(1884.37±95.21)、(486.42±33.25)、(1193.15±86.04)、(2237.94±189.55)pg/ml。DC-MUC1+survivin激发抗原特异性CTL分泌的IL-2、granzyme B、IFN-γ水平显著高于DC-MUC1与DC-survivin，差异有统计学意义(t值分别为4.157、5.205、6.114，P值均<0.05)；而分泌的IL-10的差异无统计学意义。

讨 论

DC肿瘤疫苗的实质是以特异性T淋巴细胞为基础的细胞免疫。疫苗构建的关键在于选择适合的肿瘤抗原负载方式。胰腺癌缺乏特异性肿瘤抗原，异质性大、免疫原性差。使用单肿瘤抗原负载DC构建的胰腺癌肿瘤疫苗诱导的免疫反应通常较弱；而使用肿瘤全抗原负载DC构建的胰腺癌疫苗有引发机体自身免疫疾病发生的可能。在基于肿瘤个体化治疗的前提下，通过选择数个易受T淋巴细胞影响的胰腺癌靶点抗原联合负载DC构建肿瘤疫苗[8]，可能会在保证安全的同时，达到诱导较强的机体特异性抗癌免疫反应的目的，理论上是一种较好的DC肿瘤疫苗的构建方法。MUC1是高糖基化I型糖蛋白的一种，其蛋白分子较易被免疫细胞所呈递和识别[9]。同时，MUC1的表达具有高度的肿瘤特异性，在胰腺癌细胞中的阳性表达率可达90%以上，因此被认为是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点[10]。此外，近年来的研究发现，一类全新的通用型肿瘤抗原(universal tumor antigens, UTA)几乎可以表达于所有的肿瘤细胞，而在正常组织不表达，因此其表位可以作为重要且广泛的应用性靶目标，在抗肿瘤免疫治疗中发挥作用[11]。Survivin是UTA的一种，其在胰腺癌细胞中的阳性表达率可达76.9%～88.0%[12]。鉴于survivin表达的高度肿瘤特异性及其在肿瘤的发生、发展中起关键作用，survivin也被认为是一种重要的肿瘤免疫治疗靶点。

表1 各组转染DC刺激自体T淋巴细胞的增殖指数

RNA电转染法具有操作简单、安全、不受MHC遗传背景影响等优点。本研究采用电转染技术成功将MUC1和(或)survivin抗原负载DC，且两种目标mRNA在转染过程中未出现不良交互反应。转染后的DC均有MUC1和(或)survivin mRNA的表达，但联合转染的DC的表达水平显著低于单抗原转染的DC，提示在DC的RNA转染过程中可能存在某种RNA数量方面的限制，即当转染的RNA总量较高时，DC中目标抗原的表达可能并不随同增高。单抗原转染的DC存活率稳定在80%左右，而联合转染的DC存活率明显降低，这可能与DC联合转染时所受电损伤过久以及RNA转染剂量过高引起的毒性增加有关。

本研究结果显示，联合转染的DC对自体T淋巴细胞的增殖刺激能力显著高于单转染的DC，提示随着负载抗原表位的增加，DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力亦增强。

各类肿瘤疫苗的最终目的是期望其在体内诱导特异性的CTL，从而对肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应。随着T淋巴细胞的增殖和特异性CTL的扩增，活化的CTL可分泌大量Th1型的细胞因子，如IL-2、IL-10、granzyme B和IFN-γ等，因此DC对体外CTL的刺激活化能力可间接使用IFN-γ等细胞因子的释放量表示[13]。本研究结果显示，联合转染DC激发CTL的效应较单转染DC更强，与Van Tendeloo等[14]的研究结果类似，提示DC体外激发特异性CTL的能力可能与其所负载抗原表位的数目有关，而与转染RNA的剂量无关。即随着DC负载的抗原表位数量的增加，其体外活化、激发抗原特异性CTL的能力亦会显著增强。

总之，将MUC1与survivin mRNA联合转染的DC在体外能显著促进抗原特异性CTL的增殖和活化，为胰腺癌多抗原表位DC疫苗的构建与应用提供了部分理论和实验基础。

参 考 文 献

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