胰腺癌细胞TM4SF1的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

曹佳 李磊 贺思佳 金晶 吴洪玉 徐雷鸣 李兆申

TM4SF1(transmembrane 4 L six family member 1, 也称L6,L6-Ag)是4次跨膜蛋白L6超家族成员[1]，在一些上皮来源的肿瘤，如肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等有异常高表达[2-5]。Kao等[6]报道，TM4SF1表达量与肺鳞癌患者的生存期呈正相关。Gordon等[7]报道，TM4SF1/PKM2和TM4SF1/ARHGDIA两组比值与恶性胸膜间皮瘤的术后预后相关。本课题组在前期实验中应用基因芯片对胰腺癌细胞株的mRNA进行筛查，发现绝大多数胰腺癌细胞株的TM4SF1 mRNA表达高于人正常胰腺导管细胞(human pancreatic duct epithelial，HPDE)，提示TM4SF1基因可能与胰腺癌的发生、发展有关[8]。本研究旨在进一步观察TM4SF1对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。

材料与方法

一、细胞株及实验材料

MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1胰腺癌细胞系购自ATCC(American Type Culture Collection)。HPDE细胞株由多伦多大学Tsao博士赠送。MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1及AsPC-1细胞株均在含10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培养液中培养、传代；HPAC细胞株在含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI培养液中培养、传代；HPDE细胞株在含牛垂体抽提物及上皮生长因子 的无血清角化细胞培养液中培养、传代。靶向TM4SF1基因的siRNA(siTM4SF1)及阴性对照siRNA(siNC)均购自QIAgen公司，siTM4SF1序列为5′-AAGGACCACTATGTCTTGATT-3′。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国QIAgen公司。

二、细胞TM4SF1 mRNA表达的检测

三、胰腺癌细胞TM4SF1基因表达的沉默

选取2株高表达的胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2 的对数生长期细胞，分别接种于10 cm的培养皿中，密度为50%～60%，置37℃培养箱内孵育1 h。在2个EP管中分别加入200 μl OPTI MEM、80 μl Hiperfect、8 μl siRNA(10 μmol/L的siTM4SF1或siNC)混匀，放置室温30 min后分别逐滴滴入孵育1 h的细胞内，继续孵育24 h。应用qRT-PCR方法验证瞬时转染效果。

四、胰腺癌细胞增殖检测

取转染的对数生长期细胞，采用Promega公司的细胞增殖检测试剂盒进行检测。将已转染并孵育24 h的细胞用胰酶消化，用含2%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为1.5×104/ml，接种于96孔板，每孔100 μl。转染siNC及siTM4SF1的细胞均接种4排，每排6个复孔。4排分别在培养0、24、48、72 h时每孔加入15 μl四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt, MTS]，继续培养1 h，应用lQuant通用型96孔板分光光度计进行读数。上述实验重复3次，取均值。

五、细胞迁移与侵袭力检测

采用装有Polycarbonate膜的Transwell小室检测细胞的迁移力。取转染24 h的细胞，用无血清的DMEM液调整其密度为2×105/ml。下室加入650 μl含2%胎牛血清的DMEM，上室接种100 μl转染细胞，37℃培养箱内孵育16～24 h。用棉签蘸清水擦去膜上层面的细胞，甲醇固定5 min，Hematoxylin染色3 min。镜下取8个视野计数穿膜细胞数，计算转染siTM4SF1的细胞穿膜数量较转染siNC 细胞穿膜数量减少的百分比。实验重复3次，取均值。

采用装Matrigel包被膜的Transwell小室检测细胞的侵袭力。在上室及下室分别加入500 μl无血清DMEM液后置4℃过夜，弃培养液。上室加100 μl上述的转染细胞，下室加650 μl含2%胎牛血清的DMEM液。以下步骤同细胞迁移力的检测。

六、统计学处理

应用Graphpad Prism软件进行统计分析。采用Mann-WhitneyU检验及Dunnett′s Multiple comparison检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、各细胞株TM4SF1 mRNA的表达

HPDE细胞TM4SF1 mRNA表达量为0.020±0.003，胰腺癌MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1、AsPC-1、HPAC细胞的表达量分别为1.205±0.073、1.096±0.260、1.382±0.075、1.374±0.363、0.744±0.096，均显著高于HPDE的表达量(F=22.26，P<0.01)。

转染siTM4SF1的MPanc96细胞TM4SF1mRNA表达量为0.150±0.049，转染siNC的细胞为0.924±0.162，前者的表达量下降了83.8%；转染siTM4SF1的MiaPaCa-2细胞TM4SF1 mRNA表达量为0.206±0.038，转染siNC的细胞为0.878±0.119，表达量下降了76.5%，表明TM4SF1基因的表达被显著沉默。

二、TM4SF1基因沉默对MPanc96、MiaPaCa-2细胞增殖的影响

转染siTM4SF1的MPanc96、MiaPaCa-2细胞的增殖与转染siNC的MPanc96、MiaPaCa-2细胞的增殖差异均无统计学意义(U值均=6.000，P值均=0.686，图1)。

图1 转染的MPanc96(上)、MiaPaCa-2细胞(下)的增殖曲线

三、TM4SF1基因沉默对MPanc96、MiaPaCa-2细胞迁移及侵袭力的影响

转染siTM4SF1的MPanc96细胞的迁移力较转染siNC的MPanc96细胞下降(62.5±7.6)%，侵袭力下降(69.5±5.7)%；转染siTM4SF1的MiaPaCa-2细胞的迁移力较转染siNC的MiaPaCa-2细胞下降(72.8±4.0)%，侵袭力下降(78.6±6.3)%(图2、3)。

图2 转染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜细胞(迁移力实验， ×200)

图3 转染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜细胞(侵袭力实验， ×200)

讨 论

1986年HellstromI等[2]应用10 000种单克隆抗体杂交肺癌小鼠的脾脏组织，从而发现其中14种为肺癌特异性抗体，其中的一种抗原按照当时的编号命名为L6，同时发现这L6在乳腺癌及结肠癌中也有异常表达。Marken等[9]研究发现L6是含有4次跨膜结构的膜蛋白，认为L6可能属于4次跨膜蛋白(Tetraspanins)家族。Wright等[1]发现L6及另外3种4次跨膜蛋白家族的成员，它们与家族其他成员相比虽具有相似的拓扑结构，但缺乏高度保守的CCG(Cys-Cys-GLy)序列，因此将它们从4次跨膜蛋白家族中细化出来，命名为4次跨膜蛋白L6超家族，L6蛋白也就被命名为TM4SF1。TM4SF1相对分子质量约21 000，由202个氨基酸组成。此后在一些上皮来源的肿瘤，如卵巢癌、肾癌、前列腺癌等中均发现有TM4SF1的异常高表达[3-5]。2001年Storim等[10]发现TM4SF1影响表皮角质细胞的体外迁移功能。Chang等[11]报道，TM4SF1与CD13(aminopeptidase N)相互作用，这种作用可能与肺癌细胞侵袭前蛋白改变相关。

本研究结果显示，胰腺癌细胞的TM4SF1mRNA表达水平明显高于正常人胰腺导管上皮细胞。证实了前期基因芯片检测的胰腺癌细胞TM4SF1表达增加的结果，提示TM4SF1基因可能与胰腺癌的发生、发展有相关性。应用RNA干扰技术沉默胰腺癌细胞MPanc96、MiaPaCa-2的TM4SF1基因表达，结果显示TM4SF1基因沉默后MPanc96、MiaPaCa-2细胞的增殖能力无显著变化，但细胞的体外迁移及侵袭力显著下降，推测TM4SF1与胰腺癌的侵袭、转移相关。本研究组将建立胰腺癌原位移植瘤动物模型，通过体内实验进一步验证TM4SF1对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。

参 考 文 献

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