脑源性神经营养因子在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义

胡立威 陈炯 周杭城 杨仁保 陈龙江 赵跃

胰腺癌除高侵袭性及多重耐药性外，胰周神经浸润也是其一个显著特征，发生率可达54%～100%[1]。文献证实[2]，神经浸润与患者临床手术时机的选择以及生存时间密切相关。因此，近年来越来越多的研究开始关注胰腺癌的神经浸润机制。文献报道[3-4]，胰腺内外神经组织产生的许多神经营养因子、黏附分子参与了胰腺癌的神经侵袭过程。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)自分泌表达于胃、胰实体肿瘤[4]，参与胰腺肿瘤的发生、增殖，癌细胞的转移和神经浸润[5-7]。本研究检测胰腺导管腺癌组织中BDNF基因的表达，分析BDNF表达与胰腺癌病理参数之间的关系，探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用。

材料与方法

一、临床资料

收集安徽省立医院1991年8月至2012年12月外科手术切除的46例胰腺癌及38例胰腺良性疾病患者的资料。46例胰腺癌患者中男性24例，女性22例，年龄45～76岁，病理证实均为胰腺导管腺癌。38例胰腺良性疾病患者中男性21例，女性17例，年龄 41～65岁，包括13例急性胰腺炎、8例慢性胰腺炎、9例胰腺囊肿、1例胰腺导管内乳头状瘤，7例有胰管结石。另选取20例正常胰腺作为对照组，其中男性11例，女性9例，标本来源于尸体解剖、胰腺意外伤及脾脏切除附带的正常胰腺组织。

二、免疫组化染色

取4%甲醛固定的组织标本，石蜡包埋，切片，常规行免疫组化染色。兔抗人BDNF单抗购自SantaClauz公司，工作浓度1∶200，生物素化标记的鼠抗兔二抗购自北京中杉金桥公司，工作浓度1∶200，最后加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，DAB反应染色。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。肿瘤细胞或间质内皮细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。由病理科医师盲法读片。每张切片先在低倍镜下选取胰腺细胞密集区，再在高倍镜下取10个视野计数1 000个细胞，计算染色细胞占总细胞数的百分数，以染色细胞≥20%为阳性，<20%为阴性。

三、RT-PCR法

取新鲜的组织标本，应用Trizol提取总RNA。BDNF上游引物为5′-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3′，下游引物为5′-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3′，扩增产物长度207 bp。以β-actin作为内参。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先用逆转录试剂盒(杭州博日公司)转录成cDNA，按说明书操作，再行PCR扩增。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，27个循环，最后72℃延伸7 min。取5μl PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，UVI凝胶成像扫描仪扫描，以目的条带与内参条带灰度比值作为mRNA的相对表达量。

四、蛋白质印迹法

取新鲜胰腺组织切成小块，加裂解液制备成匀浆，离心取上清进行蛋白定量。取50 μg蛋白常规行蛋白质印迹法检测BDNF表达量。以β-actin作为内参。所用抗体同免疫组化法抗体。最后滴加ECL发光，X线曝光、显影、定影。应用扫描仪扫描，以目的条带与内参条带的灰度比值表示蛋白相对表达量。

五、统计学处理

结 果

一、BDNF蛋白的表达

免疫组化染色显示，正常胰腺组织仅见少许胰腺腺泡细胞的胞质及部分导管细胞胞核出现浅黄色颗粒。胰腺导管腺癌组织中BDNF蛋白主要表达在癌细胞胞质、神经鞘膜及神经周围，且靠近神经组织的癌细胞BDNF阳性程度高于远离神经组织癌细胞(图1)，BDNF阳性表达率为52.2%(24/46)。胰腺良性疾病BDNF阳性表达率为7.8%(3/38)，其中慢性胰腺炎2例，胰腺囊肿1例。胰腺癌与胰腺良性病变的BDNF阳性表达率差异具有统计学意义(χ2=18.706，P<0.01)。

图1 正常胰腺组织(a)、慢性胰腺炎组织(b)、无神经浸润的胰腺癌组织(c)及有神经浸润的胰腺癌组织(d)BDNF蛋白的表达(HE ×200)

蛋白质印迹法检测结果显示，正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌组织中BDNF蛋白的表达量分别为0.38±0.01、0.56±0.01、0.97±0.01(图2)。胰腺癌和胰腺良性疾病组织的BDNF表达量显著高于正常胰腺组织(t值分别为11.407、13.032，P值均<0.01)；胰腺癌的表达量又显著高于胰腺良性疾病(t=6.896，P<0.01)。

二、BDNF mRNA表达

正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌组织中BDNF mRNA的表达量分别为0.85±0.14、1.67±0.21、3.45±0.67。胰腺癌和胰腺良性疾病组织的表达量显著高于正常胰腺组织(t值分别为10.304、11.425,P值均<0.01)；胰腺癌的表达量又显著高于胰腺良性疾病(t=7.525,P<0.01)。

三、BDNF表达与胰腺癌临床病理参数间的相关性

BDNF表达与肿瘤神经浸润及淋巴结转移有相关性(P值均<0.05)，而与患者年龄、性别及肿瘤直径、部位、分化程度均无相关性(P值均>0.05，表1)。

表1 胰腺癌组织BDNF表达与临床病理参数间的关系

讨 论

BDNF主要分布于大脑中枢神经系统、外周神经系统、内分泌系统、骨和软骨等组织内。BDNF在脑内主要位于大脑皮质各层、海马各区、脑干以及小脑的神经元胞体及部分神经突起。它主要定位于细胞的胞质。通过与配体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB) 特异性高亲和力结合，参与维持正常脑组织细胞的生理功能。也有研究证实[8]，BDNF可与TrkB或p75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)结合，通过胞内信号转导的瀑布效应阻断或介导细胞的程序性凋亡，从而抑制或者促进凋亡的发生[8-9]。BDNF与TrkB结合后可激活Ras癌基因，使其下游效应因子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)和Raf激酶启动PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK激酶信号途径而抑制细胞的失巢凋亡，诱导肿瘤细胞增殖和迁移[10-11]。Pearse等[12]的研究也证实，BDNF/TrkB信号转导途径可以促进肿瘤细胞的存活，有助于肿瘤的进展。

本研究结果显示，胰腺癌组织BDNF mRNA及蛋白表达量显著高于正常胰腺组织及胰腺良性疾病组织，与文献报道的结果相符[13-15]，提示BDNF可能参与胰腺肿瘤的自分泌生长刺激和浸润性生长。本结果还显示，胰腺癌组织内的神经鞘膜及神经周围亦有BDNF的表达，且靠近神经组织的癌细胞BDNF阳性程度高于远离神经组织癌细胞，可见BDNF的表达与肿瘤的神经浸润呈正相关，提示BDNF与胰腺癌神经浸润密切相关。临床病理分析结果表明,BDNF的表达与胰腺导管腺癌患者的年龄、性别及肿瘤大小、部位等因素均无显著相关性，但与胰腺导管腺癌的神经浸润及淋巴结转移显著相关，也提示BDNF表达水平可能与胰腺癌患者预后有关。

参 考 文 献

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