褪黑素对重症急性胰腺炎相关性肺损伤保护作用的研究

怀佳萍 孙学成 叶晓华 徐晓 吴建胜

在重症急性胰腺炎(SAP)引起的多器官功能衰竭中，呼吸功能衰竭占SAP第1周病死率60%[1]，肺功能障碍是除腹部脏器功能障碍外最突出的表现[2]，因此同时着眼于胰腺和肺组织是治疗SAP的新策略。Th22细胞是不同于其他任何一种类型的效应T细胞的亚型，能分泌细胞因子IL-22、IL-26和IL-13等[3-4]。IL-22能减轻组织损伤，加快组织修复，维持组织完整性，加强免疫功能及增强抗菌作用[5]。褪黑素(melatonin, MT)是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素，具有调节生殖系统、免疫系统及抗氧化、抗毒性、抗肿瘤等重要作用。本研究应用MT干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠，观察其对ANP相关性肺损伤的保护作用，探讨可能的作用机制。

一、材料和方法

1．实验动物及分组：72只健康雄性SD大鼠，清洁级，体质量200～250 g，由温州医学院实验动物中心提供。术前禁食12 h，自由饮水。按完全随机法分为假手术组(对照组)、ANP组和MT干预组(MT组)，每组24只。采用胰胆管逆行注射4%的牛磺胆酸钠(Sigma公司)1 ml/kg体质量的方法制备ANP模型。MT组术前30 min腹腔注射褪黑素(Sigma公司)50 mg/kg体质量。对照组仅打开腹腔，翻动胰腺后关腹。术后每只大鼠给予皮下注射生理盐水2.0 ml以补充术中丢失液体。术后1、4、8 h处死大鼠，留取血液、胰腺组织及肺组织。

2．血淀粉酶测定：采用全自动生化分析仪检测。

3．肺组织病理学检查：肺组织经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、4 μm切片，HE染色，光镜下观察肺组织的病理改变。

4．肺组织 IL-22含量测定：取新鲜肺组织，制备组织匀浆，离心取上清，蛋白定量后，应用ELISA试剂盒(R&D公司)测定IL-22含量，按说明书操作。

5．肺组织IL-22、Th22 mRNA表达测定：取40～50 mg肺组织，以Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA。先逆转录成cDNA，再采用实时PCR法检测IL-22、Th22 mRNA表达。引物序列：IL-22上游为 5′-GCCAGCTGCCTGCTTCTCGT-3′， 下游为5′-CTGGCCTCCTTGGCCAGCAT-3′；Th22上游为5′-GGGCTTCCAGGGTGCTTCGC-3′，下游为5′-CCTCAGTTCACCGAGAACCCCA-3′； 管家基因β-actin上游为5′-GCGTCCACCCGCGAGTACAA-3′，下游为5′-CGACGACGAGCGCAGCGATA-3′。PCR反应条件：95℃ 15 s，60℃ 45 s、72℃ 60 s，40次循环。由仪器自带软件获取Ct值，按公式2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

二、结果

1．血淀粉酶活性变化：ANP组大鼠血清淀粉酶活性较对照组显著升高；MT组大鼠血淀粉酶活性较ANP组显著降低，但仍显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P值均<0.01，表1)。

2．肺组织病理改变：光镜下，对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺间质无渗出。ANP组大鼠1 h时的肺组织结构尚清晰，肺泡壁部分破坏，间质少量渗出；4 h后肺泡壁大部分破坏，间质渗出较明显；8 h肺泡壁完全被破坏，间质有大量红细胞及中性粒细胞渗出。MT组大鼠肺组织病变较ANP组相应时间点显著减轻(图1)。

图1 对照组(a)、ANP组(b)、MT组(c)4 h时肺组织的病理改变(HE ×200)

3．肺组织中IL-22含量的变化：ANP组大鼠肺组织IL-22含量较对照组显著下降，且随着时间的延长持续下降；而MT组较ANP组相应时间点均显著升高，但仍显著低于相应时间点的对照组，差异均具有统计学意义(P值均<0.01，表1)。

4．肺组织IL-22、Th22 mRNA表达水平的变化：ANP组大鼠肺组织IL-22、Th22 mRNA表达均较对照组显著下降，且随时间延长逐渐下降，MT组大鼠肺组织IL22含量较ANP组相应时间点均显著升高，但仍显著低于相应时间点的对照组，差异均具有统计学意义(P值均<0.01，表1)。

表1 各组大鼠血清淀粉酶、肺组织IL-22含量及IL22、Th22 mRNA表达的变化

注：与对照组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.01

讨论IL-22在组织抗菌及再生中起重要作用。有学者研究表明，在炎症反应中外源性给予IL-22能减轻组织损伤，所以IL-22是炎症性疾病的潜在治疗靶点[6]。在SAP中，IL-22对环氧合酶2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、白介素1β(IL-1β)和单核细胞趋化因子1(MCP-1)等的活性和(或)数量有直接和(或)间接抑制作用，从而发挥保护作用[7]。ARDS患者器官肺泡灌洗液中IL-22含量比正常人少，表明肺部疾病时IL-22含量减少。Th22型细胞的功能主要是通过IL-22实现的。本研究结果显示，ANP组大鼠肺组织中IL-22和Th22表达水平较对照组显著下降，且随病程延长而逐渐下降。可以推测IL-22和Th22水平的下降可能是ANP时引起肺组织损伤的机制之一。

MT是一种能通过人体所有屏障[8]，且比谷胱甘肽、维生素C等更高效的氧自由基清除剂，具有很强的抗氧化作用。有研究报道，MT能减轻实验性ANP的病变严重程度[9]，但是关于MT的保护作用与IL-22和Th22水平的关系没有相关报道。本研究结果显示，MT组大鼠肺组织中IL-22和Th22水平比ANP组明显升高，MT组肺组织的病理损伤也比ANP组损伤小，这表明MT能上调IL-22和Th22活性，从而发挥对ANP相关性肺损伤的保护作用。

参 考 文 献

[1] Shields CJ, Winter DC, Redmond HP. Lung injury in acute pancreatitis: mechanisms, prevention, and therapy[J]. Curr Opin Crit Care, 2002, 8(2): 158-163.

[2] Renner IG, Savage WT 3rd, Pantoja JL, et al. Death due to acute pancreatitis. A retrospective analysis of 405 autopsy cases[J]. Dig Dis Sci, 1985, 30(10): 1005-1018.

[3] Eyerich S, Eyerich K, Pennino D, et al. Cavani A. Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling[J]. J Clin Invest, 2009, 119(12): 3573-3585.

[4] 侯卫坤, 周艳, 吕社民. Th22型细胞与炎症性疾病的关系[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2010, 26(1)：89-90.

[5] Wolk K, Witte E, Witte K, et al. Biology of interleukin-22[J]. Semin Immunopathol, 2010, 32(1): 17-31.

[6] Zenewicz LA, Yancopoulos GD, Valenzuela DM, et al. Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation[J]. Immunity, 2007, 27(4): 647-659.

[7] Adel GE, Mohammed A, Basalamah OA, et al. Interleukin-22 therapy attenuates the development of acute pancreatitis in rats[J]. J Clin Med Res, 2011, 3(6): 82-88.

[8] Bülbüller N, Dogru O, Umac H, et al. The effects of melatonin and pentoxiphylline on L-arginine induced acute pancreatitis[J]. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg, 2005, 11(2): 108-114.

[9] Qi W, Tan DX, Reiter RJ, et al. Melatonin reduces lipid peroxidation and tissue edema in cerulein-induced acute pancreatitis in rats[J]. Dig Dis Sci, 1999, 44(11): 2257-2262.