朱布仁-7微生物限度检查的方法学研究
2014-07-30宋宏春
周 刚 丁 红 宋宏春
(1.内蒙古食品药品检验所,内蒙古 呼和浩特 010020;2.呼和浩特市药品不良反应和药物滥用监测中心,内蒙古 呼和浩特 010020;3.内蒙古医科大学药学院,内蒙古 呼和浩特 010050)
朱布仁-7是由黑冰片、硼砂、胆南星、苦地丁、连翘、自贝齿、石榴7味药组成的蒙药制剂,具有消炎利胆的功效,临床上主要用于胆痞病[1]。为了有效控制其成品的质量,本文对朱布仁-7的微生物限度检查参照中国药典[2]的规定进行了方法学研究,确立了可行的微生物限度检查法。
1 试验材料及仪器
1.1 样品:朱布仁-7由正蓝旗蒙医院提供。
1.2 菌种:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。
1.3 培养基:营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、胆盐乳糖、营养肉汤、改良马丁、MUG培养基。上述菌种和培养基均由中国药品生物制品检定所提供。
1.4 仪器:三洋MLS-3750型高压灭菌器、三洋 MIR-554恒温培养箱、梅特勒-托利多PL602-L型电子天平。
2 方法验证
2.1 菌液制备
2.1.1 取经30~35℃培养18~24h大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50~100 cfu的菌悬液。
2.1.2 取经23~28℃培养24~48h的白色念珠菌改良马丁培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50~100 cfu的菌悬液。
2.1.3 取经23~28℃培养1周的黑曲霉斜面培养物,加3~5mL 0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50~100 cfu的孢子悬液。
2.2 供试品溶液的制备:称取供试品10g,加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL,作为1:10的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 平皿法:取1mL供试品溶液注皿,分别加入5株试验菌,测定回收率。
2.3.2 培养基稀释法:取0.2mL供试品溶液注皿,分别加入5株试验菌,测定回收率。
2.3.3 回收率的测定方法
2.3.3.1 试验组:常规法和培养基稀释法取规定量供试液和50~100cfu试验菌注皿,立即倾注相应的培养基,平行制备2个平皿,按规定的温度和时间培养,测定其菌数。
2.3.3.2 菌液组:取与试验组相同的50~100cfu试验菌注皿,以下同试验组,测定所加的试验菌数。
2.3.3.3 供试品对照组:常规法和培养基稀释法取规定量供试液注皿,平行制备2个平皿,按平皿法测定其供试品本底菌数。
2.3.3.4 回收率计算公式:回收率应不低于70%。
回收率 =【(试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数】×100%
2.3.4 试验结果:见表1和表2。
表1 平皿法测定5株试验菌的回收率
表2 培养基稀释法测定3株试验菌的回收率
2.3.5 结果判断:从表1可以看出,本品对白色念珠菌和黑曲霉无抑菌活性,回收率不低于70%;对金黄色葡萄球菌有抑菌活性,回收率低于70%,改用培养基稀释法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌重新验证。从表2可以看出,用培养基稀释法可消除其抑菌活性,3种菌回收率均不低于70%。说明采用培养基稀释法可测定其细菌数,采用平皿法可测定其霉菌和酵母菌数。
2.4 控制菌检查方法验证
2.4.1 大肠埃希菌的验证
菌液制备:同前菌液的制备,制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。
试验组:取1:10供试液10mL及10~100 cfu大肠埃希菌加入100 mL胆盐乳糖增菌培养基中,依大肠埃希菌检查法进行检查。
阴性菌对照组:取1:10供试液10mL及10~100 cfu金黄色葡萄球菌加入100 mL胆盐乳糖增菌培养基中,依大肠埃希菌检查法进行检查。
2.4.2 大肠菌群的验证
菌液制备:同前菌液的制备,制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。
试验组:取1:10供试液 1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中,同时分别加入10~100 cfu大肠埃希菌,依大肠菌群检查法进行检查。
阴性菌对照组:取1:10供试液 1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中,同时分别加入10~100 cfu金黄色葡萄球菌,依大肠菌群检查法进行检查。
2.4.3 试验结果:大肠埃希菌、大肠菌群方法验证结果见表3。
表3 常规法控制菌验证结果
2.4.4 结果判断:从上表可以看出,试验组检出试验菌,阴性菌对照组未检出阴性对照菌,说明本品用常规法即可检出大肠埃希菌、大肠菌群。
3 结论
采用培养基稀释法测定细菌数,采用平皿法测定霉菌和酵母菌数,采用药典常规法检查控制菌等建立了朱布仁-7的微生物限度检查方法。
[1]乔桂芳.HPLC法测定朱布仁-7中苦地丁的含量[J].中国民族医药杂志,2011,5:42-43.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010,附录ⅩⅢC.