响应面法优化紫苏多糖的水提工艺

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（1.黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080；2.黑龙江大学生命科学学院食品科学与工程系，黑龙江哈尔滨 150500）

紫苏，别名赤苏、白苏、香苏等，学名Perilla frutescens，为唇形科一年生草本植物，具有特异的芳香，原产中国，我国华北、华中、华南、西南地区均有野生种和栽培种[1]。据医学临床研究，其茎、叶及种子可入药；茎叶有镇痛、镇静[2]、解热作用，可治疗感冒、缓解鱼蟹中毒等[3]：种子（果实）有镇咳、祛痰、平喘及发散精神沉闷之效[4]。近些年来，紫苏因其特有的活性物质及营养成分，在抗凝血、抗血栓、调血脂、调节免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等方面都具有显著的药理作用[5-7]，而且紫苏油中还有大量的α-亚麻酸，成为一种备受世界关注的活性物质[8]，经济价值十分显著。俄罗斯、日本、韩国、美国、加拿大等国对紫苏属植物进行了大量的商业性栽种，开发出了食用油、药品、淹渍品、化妆品等几十种紫苏产品[9]。迄今为止，国内外对于紫苏籽的利用多用于产品开发，而对活性物质的提取研究却鲜见报道。

本实验利用微波提取速度快的特点，对微波法水提紫苏籽中的多糖进行了研究，为紫苏多糖的进一步研究奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫苏籽：哈尔滨市同泰药店。

甲醇、氯仿、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸：天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯；WG800微波炉：中国格兰仕微波炉电器有限公司；UV 1810紫外分光光度计：中国普析通用仪器有限公司；H-1650台式离心机：湖南湘仪离心机有限公司；WND-200中药粉碎机：浙江伟能达有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫苏籽的预处理

由于紫苏籽中含有较多油脂，为了减小油脂对多糖提取率的影响，首先要进行预处理去除油脂。方法是将紫苏籽称重后粉碎，加入石油醚150 mL、水100 mL浸泡紫苏粉末，静置4 h后分层，上层为石油醚提取液，下层为含水的脱脂紫苏。

1.2.2 多糖含量的测定

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[10]。得到线性回归方程Y=0.015X-0.033，R=0.994，葡萄糖标准溶液浓度为0.4 mg/mL。

1.2.3 紫苏多糖提取率的单因素实验

紫苏多糖提取单因素试验过程中，微波功率设5个水平分别为 800、640、480、320、160 W，微波提取时间设 5 个水平分别为 0.5、1.0、1.5、2、2.5 min，液料比设 5个水平分别为 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1，分别进行单因素试验测定紫苏多糖提取率，每个试验均设3个重复，取平均值。微波功率的设定参考牟番松等方法[11] 。

式中：A1为紫苏籽鲜质量；A2为紫苏多糖干质量。

1.2.4 响应面法对微波提取条件的优化

综合单因素试验结果，参照张大皓等[12]方法，通过Plackett-Burman试验统计分析，确定试验的主因素和后续实验的中心点条件，然后在最陡爬坡实验的基础上，设计实验因素及水平，应用Box-Behnken中心组合进行三因素三水平的试验设计（取a=2），通过响应面法对紫苏籽中多糖的微波提取条件进行优化。

1.3 数据统计分析

利用Design Expert7.0软件中的多元线性回归分析程序，拟合二阶多项式方程。并对回归方程的系数进行显著性比较（F检验），研究微波功率及提取时间，液料比对紫苏多糖提取率的影响，再根据响应面数据分析优化提取率。

2 结果与讨论

2.1 紫苏多糖提取率的单因素实验

2.1.1 液料比对紫苏多糖提取率的影响

选取微波功率为640 W，提取时间为2 min，选择5种不同的液料比，结果（如图1）所示，随着液料比的增大，提取率会明显的提高，但当液料比大于25∶1时，紫苏多糖提取率增加的幅度不大，而且由于液料比过大会造成溶剂用量显著增加，因此，本试验选择液料比为25∶1。

图1 不同液料比对提取率的影响Fig.1 Effect of liquid/material ratio on the extraction ability

2.1.2 微波功率对紫苏多糖提取率的影响

选取液料比为25∶1（mL/g），微波提取时间2 min，考察5种不同微波功率的影响，结果（如图2）所示，改变微波功率对紫苏多糖提取率影响较大。紫苏多糖随着微波功率的增加呈现一个先上升后下降的趋势。根据姚菁华等[13]的分析，微波加热使细胞内液态水气化产生压力，冲破细胞膜和细胞壁形成微小孔洞，有利于细胞内紫苏多糖的溶出；微波功率过大，细胞受热加剧，部分紫苏多糖的结构会破坏。故本试验选择提取微波功率为480 W左右。

图2 不同微波功率对提取率的影响Fig.2 Effect of mircowave power on the extraction ablity

2.1.3 微波提取时间对紫苏多糖提取率的影响

选定液料比为25∶1（mL/g），微波功率为480 W，考察5种不同微波提取时间的影响。结果（如图3）所示，在1.5 min内随着提取时间的延长，提取率随之增加。1.5 min后紫苏多糖得率出现缓慢下降，这主要是由于微波在1.5 min内对细胞膜的破坏作用较大，溶出物多，提取率也高。超过1.5 min后，紫苏多糖提取率呈下降趋势，因此选择微波提取时间为1.5 min左右。

图3 不同提取时间对提取率的影响Fig.3 Effect of extracting time on the extraction ability

2.2 响应面试验设计方案

首先，在单因素试验基础上，以紫苏多糖提取率（Y）为响应值，进行分式析因设计，确定了提取率的主要影响因子为液料比，达到了极显著的水平，用最陡爬坡路径逼近最大响应区域实验，采用Design expert程序中心组合试验分析法（Box-Behnken）设计试验，以 X1=（Z1-480）/160，X2=（Z2-1.5）/0.5，以 X3=（Z3-25）/5为自变量，实验因素水平见表1。响应面分析实验中17个试验点分为两类：其一是析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，共有12个析因点；其二是零点，为区域中心点，零点试验重复5次，用来估计试验误差，响应面分析方案及实验结果见表2。

表1 分析因子及水平表Table 1 Levels and factors of analysis

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2 The experiment design and results of RSM

2.3 响应面试验数据处理分析

利用Design expert软件对表2数据进行回归拟合分析，分析结果如表3。经回归拟合后，确立如下回归方程预测模型：

Y（%）=-10.9+0.018 7 X1+4.72X2+0.402 X3-0.001 59X1X2+0.000 046 9X1X3-0.014X2X3-0.000 020 6X12-1.14X22-0.007 58X32

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

从表3中可以看出，此模型P＜0.05，响应面回归模型达到显著水平。影响紫苏多糖提取率的因素主次因素为 X3＞X1＞X2，模型中 X1X2、X12、X22和 X32对提取率的影响极显著（P＜0.05）。从该模型的R2=0.969来看，此模型与实际试验拟合较好，可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析，但是试验失拟性小于0.1，说明实验数据与模型存在不相符的区域，会造成模型部分区域拟合失真。

2.4 交互作用分析

为进一步考察3个因素两两之间交互作用对紫苏多糖提取率的影响，对其响应面曲线进行分析。图4（A）、（B）、（C）直观的给出了两两因素交互作用对提取率影响的响应面图。可以看出，X1（微波功率）对响应值的影响较大，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。

2.4.1 微波功率和提取时间的交互作用

由图4可知，响应曲面的坡度相对平缓，表明响应值（提取率）对微波功率和提取时间的改变并不那么敏感，但是可以看出在响应面有两个角坡度较陡，说明微波功率和提取时间的适宜范围较窄，大致可以看出，当微波功率在360 W～580 W，提取时间在1.12 min～1.81 min之间时对提高提取率最有利，其预测提取率为1.97%。

图4 紫苏多糖提取率与微波功率和提取时间之间的响应面图Fig.4 The peak response area of the interactive effects of microwave power and duration time on the extraction ability of polysaccharide

2.4.2 微波功率和液料比的交互作用

由图5可知，响应曲面的坡度相对较陡，表明响应值（提取率）对微波功率与液料比的变化较敏感。从响应曲面可以看出，液料比变化对紫苏多糖提取率的影响更大，当微波功率在360 W～580 W、液料比在23.7～30之间对提高提取率最有利，提取率预测值为2.0%。

图5 紫苏多糖提取率与微波功率和液料比之间的响应面图Fig.5 The peak response area of the interactive effects of microwave power and liquid/material ratio on the extraction ability of polysaccharide

2.4.3 提取时间和液料比的交互作用

图6 紫苏多糖提取率与提取时间和液料比之间的响应面图Fig.6 The peak response area of the interactive effects of duration time and liquid/material ratio on the extraction ability of polysaccharide

由图6可知，响应曲面坡度相对较陡，表明响应值（提取率）对提取时间和液料比的交互作用较敏感。从等高线看，液料比的变化对响应值的影响较大。当提取时间在1.12 min～1.81 min、液料比在23.7～30之间时对提高提取率最有利，提取率预测值为2.01%。

2.5 最优工艺参数的验证

由Design expert分析，最大响应值（Y）=1.99时，X1，X2，X3对应的编码值分别为 X1=610，X2=1.31，X3=28.5，说明紫苏多糖的最佳提取条件为：微波功率610 W，微波提取时间 1.31 min、液料比 28.5∶1，紫苏多糖的提取率为1.99%。在最佳提取工艺条件下进行提取验证试验，重复3次，取平均值，紫苏多糖的提取率为2.02%，与优化目标值非常接近。

3 结论

采用响应面分析法对紫苏籽中多糖的水提工艺进行了优化，首先运用Placket-t Burman法确定出液料比为最重要的影响因素；然后通过最陡爬坡实验确定了因素水平，最后采用Box-Behnken设计和SAS软件分析确定了最优的提取工艺为：微波功率610 W，微波提取时间1.31 min，液料比28.5∶1，紫苏多糖的提取率为1.99%。而朱建飞等[14]利用传统正交试验方法得到的紫苏多糖提取率最大为8.6%，提取时间为4 h，这比本实验的提取率时间长，改用微波提取方法后，提取时间大大缩短，但提取率降到1.99%，降低了不少。曾哲灵等[15]通过响应面法优化了玫瑰茄红色素的提取工艺，张君萍等[16]利用响应曲面法优化沙葱籽多糖提取工艺，都取得了不错的试验效果。本试验通过响应面法优化紫苏多糖的提取率，同样取得了优化的紫苏多糖的水提工艺。

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