大豆粕碱性蛋白酶水解肽及A C E抑制活性的研究

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（1.天津市动植物抗性重点实验室，天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津科技大学，天津 300222）

豆粕是大豆榨油的副产物，一般用做饲料。豆粕蛋白含量很高，以其为底物，用酶解法可以制备具有降血压作用的ACE（血管紧张素转换酶angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制肽[1]。ACE 对血压起着重要的调节作用，它可以水解血管紧张素I（Angiotensin I，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Pro-His-Leu），生成的血管紧张素II具有升高血压作用，同时还可以水解舒缓激肽（Bradykinin，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Arg），使其失去降压作用[2]。中国高血压防病指南将血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）明确列为五种最常用的降压药物之一[3]，自1977年ACEI问世以来已成为防治心血管疾病的“基石”药物[4]。有关试验表明，人工合成的ACE抑制剂会产生一些副作用，而食品级蛋白源降压肽由于其安全性很高，只对高血压患者起到降压效果，对血压正常者无降压作用，且降压作用平稳而温和。因此，具有降压作用的大豆ACE抑制肽备受关注[5-6]，但以食品级豆粕为原料制备ACE抑制肽的研究相对较少。开发大豆降压食品不仅可以为心脑血管病患者提供一种物美价廉，安全可靠的保健食品还可以大幅度提高大豆产品的附加值，拓宽大豆的用途。同时，伴随生物技术的不断进步与生命科学的巨大发展，人们发掘出越来越多有关大豆多肽的功能，而某些抑制肽的结构与生理功能也逐渐被人们所认识和了解，推动了人类对大豆抑制肽进行研究与开发[7]。据此，实验以食品级大豆粕为原料制备具有降血压作用的大豆多肽并对其性质和ACE抑制活性进行研究，为大豆降压肽的开发应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用级豆粕：市购；碱性蛋白酶：天津市诺奥科技发展有限公司；硼酸（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；硼砂（分析纯）：天津市元立化工有限公司；三氟乙酸（分析纯）：上海市科丰试剂厂；甲醇（色谱纯）：美国迪马科技公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（Hippury-L-histidyl-L-leucine，Hip-His-Leu）：美国sigma公司；ACE（来自兔肺）：美国sigma公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪1200、超高压液相色谱/四极杆-飞行时间串联质谱联用仪配有电喷雾离子源（ESI）：美国安捷伦。

1.3 方法

1.3.1 酶解抑制肽样品的制备

称取豆粕，分别配制成20、40和60 g/L水溶液，50℃恒温搅拌20 min。1 mol/L NaOH调pH8.0，同时加入3%（E/S）的碱性蛋白酶。为保证溶液pH稳定，需不断向体系加入NaOH，同时记录加入量，用于计算水解度。分别于 1、2、3、4、5、6、9、12 h 取样，立即于 90 ℃水浴15 min，钝化蛋白酶。流水冷却后4℃12 500 r/min离心15 min，取上清液冻干得到抑制肽样品。

水解度的测定采用pH-STAT法[8]。

1.3.2 色谱及质谱仪器条件、

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax300SB-C18，5 μm，4.6×150 mm；检测波长：228 nm，流动相：50%甲醇-超纯水，各含0.1%的三氟乙酸；流速：0.7 mL/min；柱温：26℃；进样量：10 μL。

1.3.2.1 色谱条件

离子源：ESI；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：500℃；正离子模式下喷雾毛细管电压为4.0 KV，雾化气为N2气流量为11 L/min，干燥气压力为45 Pa，IT 真空为 2.8×10-5Tor；TOF 真空为 2.56×10-7，干燥气温度为200℃，质谱采集范围m/z 50-3000。

1.3.3 ACE抑制肽活性检测方法

1.3.3.1 试剂的配制

1）马尿酸标准液：取一定量的马尿酸标准品，加去离子水溶解配成浓度为25 μg/mL的马尿酸标准液，并逐级稀释成一系列浓度 20、15、10、5、2、1、0.5、0.1 μg/mL。

2）硼酸缓冲液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）：溶液A：称取硼酸3.092 5 g，用去离子水溶解定容至500 mL；溶液B：称取硼砂4.767 5 g，用去离子水溶解定容至500 mL；取 A 液 120 mL，B 液 80 mL，NaCl 3.51 g，混合至完全溶解，即为0.1 mmol/L的硼酸缓冲溶液。

3）ACE溶液：将0.25 U ACE溶于2.5 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）即得。

4）HHL溶液（5 mmol/L）：取适量 HHL 溶解于0.1 mol/L硼酸钠缓冲液（pH8.3含0.3 mol/L NaCl）中，配置成5 mmol/L HHL溶液。

5）称取适量冷冻干燥后的抑制肽粉末，将其溶于一定量的0.1 mol/L硼酸缓冲溶液（pH8.3，含0.3 mol/L NaCl）中，制成0.5 mg/mL抑制肽溶液。

1.3.3.2 ACE抑制肽活性测定

反应体系总体积为120 μL。

测定管：取抑制肽样品60 μL与ACE溶液10 μL混合，37℃水浴10 min后加入HHL溶液50 μL；整个反应体系37℃水浴60 min后加入1 mol/L HCL 100 μL终止反应；过0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

对照管：用60μL硼酸缓冲液（pH8.30.3mol/LNaCl）替代测定组抑制肽溶液，用同样方法制备反应液。

空白对照管：用10 μL硼酸缓冲液（pH8.3 0.3 mol/L NaCl）替代对照组ACE溶液，同样方法制备反应液（平行3次）。

计算公式为 ACE 抑制率（%）=（[HA] c–[HA] s）/（[HA] c–[HA] H）×100%

式中：[HA] c：对照样品马尿酸浓度；[HA] s：测定样品马尿酸浓度；[HA] H：空白对照中马尿酸浓度。

2 结果与分析

2.1 检测波长的测定

分别以0.1mol/L的硼酸缓冲液（pH8.3，含0.3mol/L NaCl）和去离子水为参比，在190 nm～300 nm波长处扫描马尿酸溶液和HHL溶液的紫外吸收光谱，如图1所示。

图1 马尿酸与HHL紫外吸收光谱Fig.1 UV scanning spectrum of hippuric acid and HHL

从图可以看出三肽HHL在210 nm～250 nm波长范围内有一定的吸收，而马尿酸在228 nm波长处有一特征吸收峰。因此可以用228 nm作为HPLC的检测波长。

2.2 流动相的选择及保留时间的确定

在1.3.2.1节选定的条件下马尿酸及HHL的液相色谱图如图2和图3所示。

图2 HHL液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of HHL

图3 马尿酸液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of hippuric acid

此色谱条件下，样品、马尿酸、HHL能够实现很好的区分，各峰区分度较好，马尿酸峰能和其它峰独立区分不受干扰。对加样品后的多组反应液检测后，马尿酸的峰面积减小，且出峰时间也很稳定。HHL的保留时间为Rt=6.168 min，马尿酸的保留时间为Rt=3.023 min。

2.3 抑制肽活性测定结果

2.3.1 马尿酸标准曲线及回归方程

将配置好的不同浓度的马尿酸溶液过0.45 μm滤膜后进行液相分析，结果表明马尿酸的峰面积（mAU·S）及其浓度C（μg/mL）呈现良好的线性关系，线性回归方程是：y=92.695 8x-13.91，如图4所示。

图4 马尿酸峰面积标准曲线Fig.4 The standard curve of hippuric acid

因此，马尿酸的峰面积可以很好的反映体系中马尿酸的浓度，进一步体现出ACEI的抑制活性。试验中所有样品反应体系中马尿酸的浓度全部在标准曲线范围内。

2.3.2 不同底物浓度的酶解产物ACE抑制效果

随着底物浓度的增加，酶解大豆肽的活性略有升高，并且同时在3 h时获得最高活性产物。但是考虑到生产成本以及前期处理和后期分离浓缩的困难，应尽量提高底物浓度。综合考虑下，确定40 g/L底物浓度下进行水解较适宜。（见图5）

图5 碱性蛋白酶制备的ACE抑制肽活性Fig.5 Inhibition of ACE peptide made by alcalase

2.3.3 水解度与ACE抑制活性关系

图6 水解度与抑制率的关系Fig.6 The diversification for DH and ACE inhibitory ratio

从图6可以看出，在水解反应的0 h～9 h内，水解度一直呈上升的趋势。在水解的初始阶段0 h～3 h，ACE抑制肽活性随着水解度的增加而增强[9]，随后便逐渐下降。这是因为在水解反应的后期，ACE抑制肽被水解成小分子的氨基酸，使得其活性被破坏。因此酶解3 h的产物活性最高，为64.21%，对应水解度14.86%。这与Mullally[10-11]等的研究结果是一致的，他认为在酶解反应初始阶段，ACE抑制肽被大量生成，但之后被逐步降解，从而导致ACE抑制活性下降。

2.4 高活性肽性质初步分析及测定

很多具有生理活性的生物活性肽都与其分子量有一定的关系[12]。为了明确酶解产物所含物质的分子量，对ACE抑制活性最高的3 h酶解产物进行液质分析，结果如图7。

图7 碱性蛋白酶3 h酶解产物LC-MS离子峰Fig.7 LC-MS ion peak of the alcalase hydrolysates（3 h）

结果显示样品中主要含有两种主要物质，分子量分别为 359和 441，对应分子式为 C15H30N6O4和C24H36N6O2。经SciFinder检测显示C15H30N6O4是三肽物质，由异亮氨酸、精氨酸和丙氨酸构成[13-14]。

3 结论

在pH8.0，温度50℃，底物浓度40 g/L的条件下，食品级豆粕经碱性蛋白酶水解3 h产生的ACE抑制肽活性最高为64.21%，对应水解度14.86%。Lin等从鱿鱼皮肤胃蛋白酶水解肽中获得的分子量小于2 KDa的物质，其ACE抑制IC50值为0.33mg/mL[15]。小麦胚芽蛋白脱脂后的酶解物ACE抑制IC50值0.452 mg/mL[16]。与已有文献报道相比，本实验条件下所制备的0.5mg/mL ACE抑制肽表现出了相当ACE抑制活性，经液质检测其中含有的三肽物质为C15H30N6O4。因此，本研究为开发食品级豆粕作为具有抗高血压作用的保健食品提供了理论依据，具有很大的发展前景。

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