微波辅助提取超微毛木耳粉多糖的工艺优化

（山东农业工程学院食品科学与工程系，山东济南 250100）

毛木耳[Auricularia Polytricha（Mont）Sacl.] 又称白背毛木耳，属于真菌门，担子菌纲，木耳目，木耳科，木耳属中的毛木耳种。毛木耳富含蛋白质、多种矿物质元素和维生素，背面的绒毛中含有丰富的多糖，据研究表明毛木耳多糖具有提高免疫力[1]、抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗凝血、抗血栓、降血脂[4]等作用。

在目前的研究中以黑木耳多糖的研究居多，对毛木耳多糖提取工艺的研究相对较少，但毛木耳产地分布广泛，产量丰富，目前对毛木耳的开发和利用仍停留在初级加工的水平，即产品形式多为干鲜品，产品价格低廉。为提高毛木耳的附加值，开发精深加工产品，目前大多采用热水浸提法提取多糖类物质[5]。近年来，微波技术的应用得到很大发展。微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点，应用于植物细胞破壁，可有效提高收率[6-8]。超微粉碎也是一项高新技术，可将原物料粉碎到10 μm～25 μm左右，在该细度条件下，一般物料细胞破壁率＞95%，采用超微粉碎通过细胞破壁使物料中的生物活性成分较好地暴露出来，而不再需要通过穿透细胞壁或细胞膜才能释放；同时，物料微粉化后颗粒体积变小，表面积急剧增加，从而有助于提高活性成分的利用率[9-10]。

本实验为提高毛木耳中多糖的得率，采用响应面优化法对微波辅助提取毛木耳超微粉中多糖的工艺进行研究，为毛木耳的进一步开发提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

毛木耳：采自山东农业工程学院实验基地。

1.1.2 主要试剂

浓硫酸、苯酚、葡萄糖均为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备

WF-20型万能粉碎机：江阴耐驰机械科技有限公司；ND7-2L型球磨粉碎机：南京南大天尊电子有限公司；WZJ-6J型振动式超细粉碎机：济南倍力粉技术工程有限公司；XO-SM200超声波微波组合系统（超声波频率25 KHz，功率0 W～1 000 W；微波频率2 450 MHz，功率50 W～1 000 W）：南京先欧仪器制造有限公司；TGL16台式高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；UV2000分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；KH-6HMTN2型微波干燥机：山东科弘微波能有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超微粉的制备

原料毛木耳→万能粉碎机→一级毛木耳粗粉碎（细度40目左右）→球磨机→过筛得到粗粉（平均100目）→超细粉碎振动磨→超微粉（95%以上过300目的毛木耳超微粉）

1.2.2 多糖提取工艺

准确称取300目超微粉，在一定的条件下经超声波微波组合系统中的微波功能提取毛木耳超微粉多糖，提取液先定容，再离心，然后取上清液进行测定。

1.2.3 毛木耳超微粉多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定毛木耳超微粉多糖的含量[11]。

1.2.3.1 葡萄糖标准曲线的制作

准确称取标准葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中加水至刻度即得葡萄糖标准溶液。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 葡萄糖标准溶液各以蒸馏水补至2.0 mL。以2.0 mL蒸馏水作为空白在10个样品中加入6%的苯酚1mL和浓硫酸5mL。静置10min后摇匀，室温放置20 min，然后在490 nm处测量样品的吸光值。以多糖浓度为横坐标x，吸光度值为纵坐标y，绘制标准曲线，得线性回归方程y=0.046 6x+0.001 7，R2=0.9993，线性关系好。

1.2.3.2 样品多糖含量的测定

吸取样品液1.0 mL，按上述步骤测定吸光度，根据回归方程计算样品多糖含量，从而得各实验组毛木耳超微粉多糖得率。

1.3 单因素试验

取毛木耳超微粉1.0 g分别考察水料比、微波功率、微波时间3个单因素对毛木耳超微粉多糖得率的影响，根据试验结果和实际情况确定响应面优化实验的因素及水平。

1.4 响应面优化实验

根据单因素试验的结果分析和Box-Behnken原理，运用Design-Expert 7.0.0软件进行响应面设计，优化毛木耳超微粉多糖的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 水料比对毛木耳超微粉多糖得率的影响

称取1.0 g毛木耳超微粉，在微波功率为600 W，微波时间 2.0 min 的条件下，分别以 40、60、80、100、120 mL的水提取毛木耳超微粉多糖，提取后定容至250 mL，离心取上清液测定吸光度，计算多糖得率。以水料比为横坐标，多糖得率为纵坐标作图。

图1 水料比对多糖提取效果的影响Fig.1 Effect of ratio of water to raw material on the extraction of polysaccharides

由图1可知，随水料比的增大多糖提取得率增加，由20.47%提高到25.81%，继续增大水料比，多糖得率呈下降趋势。当水料比为120时，多糖得率为19.86%，比水料比为60 mL/g时的多糖得率下降了5.95%。分析原因可能为提取液过少时多糖提取不充分导致提取得率过低，料液比过大，提取体系物料较多，升温慢，从而影响多糖提取得率。因此毛木耳超微粉多糖提取的水料比为60 mL/g左右时能获得最高的提取得率。

2.1.2 微波功率对毛木耳超微粉多糖得率的影响

称取1.0 g毛木耳超微粉，在微波时间2.0 min，水料比 60 mL/g的条件下，分别以 300、400、500、600、700、800 W的微波功率提取毛木耳超微粉多糖，定容至250 mL，离心取上清液测定吸光度，计算多糖得率。以微波功率为横坐标，多糖得率为纵坐标作图。

图2 微波功率对多糖提取效果的影响Fig.2 Effect of microwave power on the extraction of polysaccharides

由图2可知，微波功率在300 W～600 W之间时，随微波功率的增大，多糖提取得率增加，当功率增加到600W时，多糖得率最大，从20.64%增加到31.93%，多糖得率增加了11.29%，然后多糖得率呈明显的下降趋势。当功率增加到800 W时，多糖得率为23.14%。比功率600 W时的多糖得率下降了8.79%。

2.1.3 微波时间对毛木耳超微粉多糖得率的影响

称取1.0 g毛木耳超微粉，在微波功率600 W，水料比 60 mL/g的条件下，分别以 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min的微波时间提取毛木耳超微粉多糖，定容至250 mL，离心取上清液测定吸光度，计算多糖得率。以微波时间为横坐标，多糖得率为纵坐标作图。

图3 微波时间对多糖提取效果的影响Fig.3 Effect of microwave time on the extraction of polysaccharides

由图3可知，提取时间在1 min～2 min时，随着处理时间的延长，多糖提取得率逐渐增大，多糖得率由23.48%增大到29.34%。这是由于处理时间过短，微波对物料细胞膜的破坏作用有限，使得多糖得率较低，随时间的延长微波对细胞膜的破坏作用增大，多糖溶出增多，使多糖得率相应增加，但超过2.0 min后提取得率不再增加，因此初步确定微波处理时间为2.0 min。

2.2 响应面实验结果与分析

2.2.1 响应面分析试验设计及结果

利用响应曲面法研究水料比、微波功率和微波时间对毛木耳超微粉多糖得率的影响，根据Box-Behnken的设计原理，分别以A、B、C代表，每一个自变量的低中高试验水平分别以-1、0、1进行编码（见表1），以毛木耳超微粉多糖得率为响应值（Y）。在单因素试验基础上，确定各变量的水平范围，试验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

采用三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验，其中标准序1～12组为析因试验，13～17组为中心试验，用来估计试验误差。为了避免人为因素导致的系统误差，将标准序打乱，按照运行序来进行响应面试验，响应面分析试验设计及结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 二次回归模型拟合及方差分析

应用Design-Expert对试验数据进行多元回归拟合，得到毛木耳超微粉多糖得率与所选3个因素的二次多项回归模型为：

Y/%=-156.066 5+1.745 367A+0.329 22B+32.353 5C+7.75×10-5AB+0.071 25AC+0.021 5BC-0.015 893A2-3.144 75×10-4B2-12.269C2

式中：Y为毛木耳超微粉多糖得率；A为水料比；B为微波功率；C为微波时间。

对表2中试验结果进行统计分析，得方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance of the primarily established quadric regression model

由表3可知，回归模型的显著水平较高，模型极显著（P＜0.01），模型失拟度不显著（P=0.640 4＞0.05）。模型的确定系数R2为0.915 9，表明回归方程能够很好地模拟真实曲面，该试验方法是可靠的。信噪比为7.044，大于4，说明该模型拟合度和可信度均较高[11-12]。因此，可以用该模型方程来分析和预测不同提取条件下毛木耳超微粉多糖得率的变化。

根据表3中的方差分析结果，可见二次项A2对响应值 Y 影响极显著（P＜0.01）；二次项 B2、C2对响应值Y影响显著（P＜0.05）；其余项均不显著（P＞0.05）。

2.2.3 响应面交互作用分析

根据回归模型，将任一因素固定在零水平，可以得到体现另外两个因素及其交互作用影响的响应曲面图及对应的等高线图[13]，见图4～图6。

由图4～图6和表3可知，模型中的水料比二次项对毛木耳超微粉多糖得率有极显著影响，微波功率、微波时间二次项对毛木耳超微粉多糖得率有显著影响，而水料比、微波功率、微波时间一次项和水料比和微波功率之间、水料比和微波时间之间、微波功率和微波时间之间的交互作用较小，对毛木耳超微粉多糖得率影响较小。

图4 水料比和微波功率对多糖提取效果影响的响应面及等高线Fig.4 Responsive surface and contours of the effect of ratio of water to raw material and microwave power on the extraction of polysaccharides

图5 水料比和微波时间对多糖提取效果影响的响应面及等高线Fig.5 Responsive surface and contours of the effect of ratio of water to raw material and microwave time on the extraction of polysaccharides

图6 微波功率和微波时间对多糖提取效果影响的响应面及等高线Fig.6 Responsive surface and contours of the effect of microwave power and microwave time on the extraction of polysaccharides

2.2.4 毛木耳超微粉多糖提取工艺条件的确定与验证

根据回归模型通过Design Expert软件分析得出毛木耳超微粉中多糖提取的最优条件为：水料比6 0.9mL/g，微波功率599.95 W，微波时间2.02 min。在此条件下，毛木耳超微粉多糖得率的预测值为28.549%。考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数稍作调整为：水料比60 mL/g，微波功率600 W，微波时间2.0 min。

为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件重复实验3次，毛木耳超微粉多糖得率为平均值为28.78%，与模型理论最大值28.549%的相对误差为0.81%，说明模型可以较好的反映出毛木耳超微粉多糖提取的条件，从而也说明了用响应面法对毛木耳超微粉多糖提取条件参数进行优化可行。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计及响应面分析，建立了毛木耳超微粉中多糖提取的二次多项式回归模型。经检验证明该模型是合理可靠地，能够较准确的预测毛木耳超微粉中的多糖得率。

综合考虑各方面的因素，确定微波辅助提取毛木耳超微粉中多糖的优化条件是：水料比60 mL/g，微波功率600 W，微波时间2.0 min，此条件下毛木耳超微粉多糖的提取得率可达28.78%，与预测值的相对误差为0.81%，证明响应面优化法得到的提取工艺科学合理，准确可靠。可为毛木耳超微粉多糖的生产提供一定的理论参考。

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