二甲双胍对非酒精性脂肪肝细胞模型PGC-1α及脂质表达的影响

程 靖，张 宝，管石侠，侯丽丽，蒋建华

非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大疱性脂肪变性为病理特征，与高胰岛素血症、血脂异常、2型糖尿病以及遗传—环境—代谢应激密切相关的临床综合征［1］。二甲双胍作为一种降血糖药物可以在不刺激胰岛素分泌的基础上改善胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和高胰岛素血症，还可以直接作用于胰岛素靶细胞如肝脏细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等，通过受体后机制增加胰岛素的敏感性，因而二甲双胍也被用于非酒精性脂肪肝的治疗。过氧化物酶体增生物激活受体 γ 共激活因子－1α (peroxisome proliferator－activated receptor γ coactivator－1α，PGC－1α)是一种核转录共激活因子，在糖脂代谢是一种核受体转录辅助活化因子，可通过激活糖异生、脂肪酸氧化、线粒体呼吸的关键酶参与了IR、线粒体损伤和脂代谢紊乱的形成，而这些目前已经被公认参与NAFLD的发生机制。该研究拟通过检测非酒精性脂肪肝细胞模型中PGC－1α基因的表达变化，探讨二甲双胍用于非酒精性脂肪肝治疗的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂 人肝细胞株(L－02)购自中国科学院上海细胞库;RPMI 1640无糖无酚红培养基、1∶125胰蛋白酶购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国Hyclone公司;链霉素、青霉素购自华北制药华胜公司;二甲双胍购自美国Sigma公司;TG检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TRIzol、2×Tap PCR Master Mix及逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养与分组 参照文献［2］方法建立模型组，正常人 L－02肝细胞株用含10%胎牛血清的1640培养基培养于25 ml培养瓶，置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。将离体培养的肝细胞传代培养24 h后，待细胞生长稳定、融合度约达80%时，加入 20 μg/ml油酸(油酸以0.5%DMSO溶解)诱导肝细胞脂肪变性，细胞隔天换液并加入新配制的油酸。油酸作用72 h形成非酒精性脂肪变性肝细胞模型。对照组加入含10%胎牛血清的普通1640培养基。在模型组中分别添加含2.5、5、7.5 mmol/L终浓度的二甲双胍培养基分别建立低、中、高剂量组，继续培养24 h后收集细胞。

1.3 非酒精性脂肪变性肝细胞模型的鉴定 电镜观察:用40 ml培养瓶培养细胞，油酸作用72 h用胰酶消化收集细胞，并制作透射电镜标本行电镜观察。各组细胞内TG的生化检测:具体步骤见1.5。

1.4RT-PCR法测定PGC-1α mRNA的表达 细胞总RNA的提取采用TRIzol一步法，按说明书操作。逆转录合成单链cDNA后进行PCR。引物设计及引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PGC－1α 上游引物序列为:5'－CAGCAAGTCCTCAGTCCTCAC－3'，下 游 引 物:5'－TGCCTCCAAA GTCTCTCTCAG－3'，产物大小 247 bp;β－actin 上游引物序 列 为:5'－GAAATAAGAACACCCCTTC－3'，下 游引物:5'－TTGCCGACAGGATGCAGAA－3'，产物大小100 bp。扩增条件为:预变性95℃ 5min，进入循环，95 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，32 个循环后72℃ 10 min。将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统，用LabWorks 4.5软件进行积分吸光度值(IA)测定，目的基因的IA与内参吸光度值的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.5 各组细胞内TG的检测 采用6孔板，每孔植入约1×105个细胞，按上述方法分组处理，培养24 h后弃去上清液，收集各组培养板上的细胞，反复冻融裂解细胞，3 000 r/min离心10 min，取上清液检测TG。采用TG检测试剂盒，按试剂盒的说明书检测TG含量。

1.6 电镜观察 由安徽省立医院电镜室专业人员固定和处理细胞、切片，观察细胞器、线粒体和脂滴形成情况。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行分析，数据用±s表示。两组间计量资料比较采用t检验，同组不同浓度间比较采用方差分析，两因素间的相关性用直线相关分析法进行分析。

2 结果

2.1 电镜下观察有无线粒体损伤及脂滴变化 对照组细胞中可见少量大小不等的脂滴，线粒体呈椭圆形或圆形，嵴膜清晰。模型组细胞中脂滴明显增多(生化检测示模型组细胞内TG水平明显升高，说明油酸诱导造模成功)，少数线粒体出现空泡样改变。低、中剂量组细胞中可见脂滴分布，线粒体空泡样改变有所减少。高剂量组细胞中可见较少脂滴，线粒体稍肿胀，但线粒体嵴膜清晰。见图1。

2.2 不同浓度二甲双胍对L-02细胞内TG含量的影响 与对照组比较，模型组细胞内TG水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，高剂量组细胞内TG明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05);与低剂量组比较，高剂量组细胞内TG明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 二甲双胍和L-02细胞内TG的含量(±s)

与模型组比较:*P＜0.05;与对照组比较:#P＜0.05;与低剂量组比较:△P＜0.05;与中剂量组比较:▽P＜0.05;与高剂量组比较:▲P＜0.05

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2.3 不同浓度二甲双胍对L-02细胞PGC-1α mRNA变化的影响 与对照组比较，模型组L－02细胞中PGC－1α mRNA表达量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组细胞内PGC－1α mRNA表达量明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。与低剂量组比较，高剂量组细胞内PGC－1α mRNA表达量明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 二甲双胍和PGC-1α灰度值(±s)

表2 二甲双胍和PGC-1α灰度值(±s)

与模型组比较:*P＜0.05;与对照组比较:#P＜0.05;与低剂量组比较:△P＜0.05;与中剂量组比较:▽P＜0.05;与高剂量组比较:▲P＜0.05

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图2 L-02细胞PGC-1α mRNA相对表达量

2.4 肝细胞中PGC-1α基因表达水平与TG的相关性 L－02细胞中PGC－1α基因的表达水平与细胞内TG的水平呈负相关 (r=－0.581，P＜0.05)。

3 讨论

NAFLD患者经常伴有代谢综合征病症如肥胖、葡萄糖耐量受损、2型糖尿病、高血脂和高血压等，这些伴随疾病不仅能增加发生心血管疾病的风险还可能进一步加重肝脏的损害。因此，对于NAFLD的治疗，关键在于改善与IR有关的代谢紊乱。胰岛素增敏药物二甲双胍在NAFLD的治疗中，不仅对改善IR、肝脏血清酶学指标和体重有明确的疗效［3］，而且对肝脏脂肪变性、肝细胞损伤和NAFLD活动评分也有一定作用［4］。而最近一些研究［5－7］显示二甲双胍虽能改善IR等代谢紊乱症状却对肝脏组织学改善不明显，这可能与各研究中二甲双胍剂量、观察时间及评价方法不同等有关。所以对该药的具体疗效、治疗机制及其副作用仍有待研究。

二甲双胍作为一种口服降糖药可促进外周组织对葡萄糖的利用和减少肝糖的输出。PGC－1α作为一种协同刺激因子，可与不同受体及转录因子结合发挥不同生理功能。PGC－1α在肝脏中的主要作用为促进肝糖异生及调节肝脏脂肪酸氧化。在肝脏中，PGC－1α 对PPAR－α 有协同刺激作用，可增加脂肪酸β氧化酶的转录活性。PGC－1α还可通过激活肝脏脂肪酸β氧化的限速酶肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT)的表达启动脂肪酸β氧化。有研究［8］显示腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)活化可通过激活PPARα和PPARγ的复合激活因子PGC－1增加小鼠骨骼肌细胞的脂肪酸氧化。

本研究显示，与对照组肝脏细胞比较，油酸诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型中TG的含量明显增多，而PGC－1α mRNA的表达量明显下降。给予二甲双胍药物干预后，低、中、高剂量组细胞中的TG水平明显低于模型组，而PGC－1α mRNA的表达量有所增加，且细胞中PGC－1α基因的表达水平与细胞内TG的水平呈负相关，这提示改善PGC－1α的表达可减少肝脏细胞中脂质的堆积。有研究［9］显示二甲双胍可以增加人类骨骼肌细胞及心衰患者心肌细胞中PGC－1α的表达。在人类的肌小管中，PGC－1α的过表达增加了棕榈酸的氧化速率和调节脂质代谢相关基因的mRNA表达，并促进了线粒体的生物合成功能［10］。目前关于人肝脏细胞中 PGC－1α的表达水平及二甲双胍干预的体外实验较少，但有研究［11］显示在成年小鼠的肝脏细胞中二甲双胍可阻止雷帕霉素靶蛋白复合物2(TORC2)－调节的PGC－1α的上调，所以二甲双胍对肝脏细胞 PGC－1α表达的影响及具体分子机制还有待进一步研究。

综上所述，PGC－1α与脂肪酸氧化、线粒体生物功能和脂代谢紊乱密切相关，研究不同浓度二甲双胍对PGC－1α表达的影响，可进一步明确二甲双胍用于NAFLD治疗的分子机制。二甲双胍已被证实为AMPK的激活剂，由此可推测二甲双胍可能通过活化细胞内调节因子AMPKα从而激动PGC－1α基因的表达，以增加脂酶的活性和提高胰岛素敏感性，在调节肝脏的脂肪代谢功能和改善肝细胞脂肪变性等方面具有显著效果。

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