同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠体内心肌缺血微环境中的分化及存活

张 静，魏 峰，吴忠东，王亭忠，倪雅娟，马爱群

缺血性心脏病通过骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植修复或替代严重受损或坏死的心肌细胞来改善心脏功能、逆转心肌重构已成为目前的研究热点［1］。已有大量动物实验研究［2－4］表明，心肌梗死区域同种异体 MSCs的局部移植可改善心脏功能，但同时也有研究［2］观察到部分心肌梗死患者接受移植后发生心律失常等异质性改变。移植的MSCs分化具有微环境依赖性［5］，在心肌缺血微环境下，移植的MSCs是向正常心肌细胞方向分化还是向受损或异常的心肌细胞或纤维瘢痕组织分化需要进一步探讨。该研究拟观察同种异体的MSCs在大鼠体内心肌缺血微环境下心肌特异性标志物的表达及分化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 80 g清洁级雄性SD大鼠1只，180～200 g清洁级雄性SD大鼠62只，均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。80 g大鼠用于骨髓供体，分离培养MSCs，180～200 g大鼠用于建立心肌梗死(myocardial infarction，MI)模型。

1.2 主要仪器及试剂 BX51型正置光学显微镜购于日本Olympus公司;BL-420生物机能实验系统购于成都泰盟科技有限公司;HM325石蜡切片机购于德国MICROM公司;激光显微切割仪购于瑞士LEICA 公司;MYH、Cx43、cTnI、α-actin抗体购于美国Santa Cruz公司;兔抗山羊IgG-FITC购于北京中杉金桥生物技术公司;山羊抗兔IgG-Cy3购于北京康为世纪生物科技有限公司;TUNEL试剂盒购于美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的分离培养与标记 采用Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化SD大鼠MSCs，采用文献［6］的方法，以携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的慢病毒载体转染标记纯化的MSCs。

1.3.2 MI模型的建立 100 g/L水合氯醛以3 ml/kg的剂量腹腔注射麻醉健康成年SD大鼠，常规备皮、消毒、铺巾，剪开皮肤，钝性分离胸大肌和前锯肌，用血管弯钳穿透肋间肌进入胸腔并沿肋间隙方向撑开，另一血管弯钳沿垂直肋间隙方向撑开肋骨，适当用力将心脏挤出，迅速在左心耳与肺动脉圆锥交界处平左心耳下缘2 mm处，以7/0无损伤缝合线结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)近端，结扎后立即将心脏归位并置入接注射器的引流管，对合皮肤的同时抽出胸腔内气体约2 ml，立即拔管并行胸外按压，体表心电图观察有无心肌梗死后的心电图改变，待心律、心率恢复正常且呼吸平稳后，缝合皮肤，术后连续3 d肌肉注射青霉素钠。

1.3.3 MSCs的体内移植 将成功建立MI模型的53只大鼠2周后接受MSCs移植，采用建立MI模型的同样方法麻醉、开胸、暴露心脏，用1 ml胰岛素注射器于MI周边区均匀迅速注射6×106个MSCs(约0.15 ml细胞悬液)，注射后的心脏归位、恢复胸腔负压、关胸及术后护理同MI模型的建立步骤。

1.3.4 心肌组织标本的提取 将以上成功建立移植模型的41只大鼠于第3、5、7、9天分别随机处死10、10、10、11只。前 3 d处死的 10只中，5只用于免疫荧光染色，5只用于Real-time PCR法检测，第9天处死的11只中，6只用于免疫荧光染色，5只用于TUNEL凋亡染色。

1.3.5 免疫荧光染色 将第3、5、7、9天处死的大鼠心脏取出，冲净残血，切取注射部位的心肌组织，40 g/L多聚甲醛固定12 h，200 ml/L蔗糖溶液脱水12 h，OCT包埋组织，冰冻，连续组织切片，行常规免疫荧光染色;一抗稀释浓度为1∶100，二抗稀释浓度为1∶100;激光共聚焦显微镜观察染色结果。

1.3.6 Real-time PCR 法检测 同 1.3.5 中方法取出心脏，切取注射部位的心肌组织，制备连续冰冻组织切片，方法同免疫荧光染色。应用激光显微切割仪捕获切片上GFP标记的MSCs，采用单细胞PCR试剂盒中说明书推荐的方法裂解其RNA，并行逆转录反应，反应条件为:25℃ 10 min;50℃ 20 min;85℃5 min;Real-time PCR反应条件为:50℃2 min;95℃ 2 min;95℃ 15 s;60℃ 30 s;共50个循环，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。计算GFP标记的MSCs相对于未移植MSCs的基因拷贝数。采用2－ΔΔCt的方法计算其相对表达量。

1.3.7 TUNEL凋亡染色 处死9 d的大鼠，分离注射部位的心肌组织，冲洗数次，40 g/L多聚甲醛固定12 h，200 ml/L蔗糖溶液脱水12 h;用OCT包埋组织，－80℃保存;连续冰冻切片，吸附到用多聚赖氨酸处理过的载玻片上;添加100 μl的20 μg/ml蛋白酶K稀释液(10 mg/ml蛋白酶K原液，用PBS 500∶1稀释)，室温孵育30 min;再次固定，滴入E-quilibration缓冲液10 min后滴加rTdT反应混合物同时覆盖塑料盖膜，37℃湿盒中孵育60 min;避光环境下加入 Streptavidin HRP稀释液(用 PBS 500∶1稀释 Streptavidin HRP)，室温孵育 30 min;PBS冲洗后加入DAB稀释液，室温干燥30 min;荧光显微镜结合光学显微镜观察结果并拍照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料采用±s表示，两组均数间比较采用独立样本t检验，可采用检验水准取0.05。

2 结果

2.1 移植MSCs的分布特点及其主要心肌特异性标志物蛋白的表达 通过免疫荧光染色观察移植的MSCs在心肌组织内呈带状分布，排列方向与心肌细胞一致，于移植后3 d开始持续表达MYH、Cx43，移植后5 d开始持续表达cTnI，不表达α-actin，见图1。

图1 GFP标记的MSCs在心肌缺血微环境中心肌特异性标志物蛋白的表达 免疫荧光染色×600

2.2 移植的MSCs主要心肌特异性标志物mRNA的表达 与未移植 MSCs相比，移植的 MSCs中MYH、Cx43于移植后3 d表达明显增多(P＜0.05)，cTnI于移植后5 d表达明显增多(P＜0.05)。其中，MYH于移植后5、7 d较3 d表达量明显增多(P＜0.05)，Cx43、cTnI于移植后7 d较5 d表达量均增多 (P＜0.05)，见图2。

图2 Real-time PCR法测定特异性标志物的mRNA相对表达量

2.3 移植的MSCs数量的变化 移植的MSCs起初数量众多、存活良好，但随着移植时间的延长，细胞数量逐渐减少，于移植后第9天基本全部丢失，见图3。

图3 移植的MSCs数量变化 免疫荧光染色×600

2.4 TUNEL凋亡染色 9 d时移植的MSCs细胞数量明显减少，行TUNEL凋亡染色示移植的MSCs在光镜下呈棕褐色，见图4。

3 讨论

MSCs因具备储量丰富、易于分离、培养、扩增、无染色体异常或端粒酶缺失、不易刺激异体免疫细胞增殖等优点而成为该领域的热点细胞［7］，大量的动物实验、临床试验已证实MSCs的移植可以修复坏死的心肌细胞，从而改善心脏功能。有实验证实移植的MSCs的分化具备环境诱导依赖性［8］。移植的MSCs所处环境是病态环境，周围既有正常的心肌细胞，也有受损或异常的心肌细胞以及纤维瘢痕组织等，然而，MSCs具有多向分化潜能，是否能向正常心肌细胞方向分化有待证实。本实验证实移植的MSCs可以表达心肌特异性蛋白 cTnI、MYH、Cx43，未观察到α-actin的表达。

图4 移植的MSCs凋亡染色 TUNEL凋亡染色×600

cTnI是肌钙蛋白3种基因亚基之一，具有较高的心肌特异性。本实验证实移植的MSCs随着移植时间的延长，cTnI表达且表达量不断增加，这初步验证了移植的MSCs朝着心肌样细胞方向分化。

与心肌收缩有关的肌原纤维的主要成分是肌球蛋白与肌动蛋白。MYH是肌球蛋白重要组成部分，本实验证实移植的MSCs于移植后3 d开始表达MYH，并随着时间的延长，表达有所增加，这为移植的MSCs收缩及与宿主心肌细胞协调运动提供了结构蛋白基础。然而本实验证实了移植的MSCs不表达作为肌动蛋白主要亚型之一的α-actin，但Fukuda［9］研究发现MSCs在体外可分化为心肌细胞和肌小管，表达α-actin。这与本实验结果不符合，究其原因，α-actin的未表达考虑可能与移植细胞存活时间短而未完成分化相关，同时α-actin的缺失表达致使移植的MSCs缺乏结构蛋白的支持而逐渐丢失，其具体机制需要进一步证实。

Cx43是机械偶联主要的中间连接蛋白，在与宿主心肌细胞间的信号传导方面起着重要作用。Shake et al［10］将 Di-I标记的自体 MSCs 注射入猪心肌梗死模型的梗死心肌内，2周后可检测到Cx43与宿主心肌细胞发生电-机械偶联。Pijnappels et al［11］发现上调Cx43的表达可以提高心肌细胞间电偶联及心肌间传导速度增加，可以减少心肌梗死后心律失常的发生。本实验证实移植的MSCs于3 d后即可观察到Cx43的表达，移植细胞及宿主细胞之间提供了信号通道，与宿主心肌之间初步形成了电-机械偶联，为改善心脏的功能奠定结构基础。

本实验同时证实MSCs随着移植时间的延长，细胞数量逐渐减少，移植后第9天基本全部丢失。既往已有大量实验证实MSCs免疫原性低，其诱导分化的组织免疫排斥反应弱，且可来源于异体，避免了组织配型和免疫排斥反应的问题［12］。这就为同种异体之间的安全及有效移植奠定了基础。但有实验证实MSCs移植后24 h，超过50%的细胞发生了凋亡，1周后超过90%的细胞发生了凋亡［13］。凋亡的具体机制尚不明确，推测微环境可能是影响MSCs存活的主要因素。第一，移植区域周边心肌细胞因坏死而肌纤维的断裂、细胞间网格结构破坏以及移植的MSCs自身结构框架蛋白如α-actin的表达缺失或不完全等均可导致移植的MSCs失去存活的空间;第二，移植的MSCs在微环境中缺乏足够的营养能量供给，某些心肌标志物的表达缺失可能会引起MSCs向心肌细胞分化的过程中线粒体能量代谢障碍，导致能量缺失;第三，局部注射的移植方法可能会导致移植的MSCs炎症细胞聚集于移植区、分布高度不均匀而引起心肌细胞的急性炎症反应;第四，可能与移植的MSCs的GFP表达沉默相关，致使GFP标记的原位细胞绿色荧光消失而观察不到，Schierling et al［14］研究表明移植后3 d其标记的GFP表达沉默。

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