膀胱尿路上皮癌中MIF与VEGF的表达及其临床意义

张 珺，吴 奎，肖 峻，陈远哲，熊 宇

巨噬细胞移动抑制因子(microphage migration inhibitor factor，MIF)主要由活化T淋巴细胞分泌，早期发现与炎症反应及免疫应答有关的细胞因子。近年来研究［1］显示，MIF在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用，具体表现在促进细胞的增殖、分化、肿瘤血管的形成、肿瘤侵袭能力，甚至抑制肿瘤细胞的凋亡等。实体肿瘤血管的形成是其生长和迁徙的基础，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是新生血管形成过程中最重要的刺激因子之一，它能够通过诱导肿瘤血管的形成促进肿瘤的浸润转移。研究［2］显示VEGF与膀胱移形细胞癌的侵袭能力有关，并可能作为判断预后的指标。该研究主要探讨MIF与VEGF在膀胱尿路上皮癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)组织中的表达及其临床意义，并分析二者之间可能存在的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集2011年2月～2012年6月在安徽医科大学附属省立医院泌尿外科接受手术治疗的BTCC患者75例，男45例，女30例，年龄16～81(58.30±22.61)岁。根据国际抗癌协会2009年第7版TNM病理临床分期和2004年WHO病理分级标准进行组织学分级和分期，其中表浅性(Ta～T1期)50例，浸润性(T2～T4期)25例。低度恶性倾向尿路上皮乳头状瘤28例，低分级BTCC 26例，高分级BTCC 21例。伴有淋巴结转移患者21例，无淋巴结转移患者54例。患者均行手术治疗，其中，经尿道膀胱肿瘤电切术47例，膀胱部分切除术24例，全膀胱术4例。另取12例正常膀胱黏膜组织作为对照组。标本取材后分两部分，一部分立即放入RNA组织保护液中，4℃过夜，－80℃保存用于RT-qPCR;另一部分经过10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片后用于免疫组化染色。

1.2 主要试剂 抗人MIF单克隆抗体购自北京博奥森生物制药公司;抗人VEGF、CD31单克隆抗体、S-P试剂盒(含二抗、DAB显色剂)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;荧光定量PCR检测系统购自德国 Biometra;TRIzol Reagent、RNase抑制剂、反转录酶(含 buffer)、dNTP、SYBR Green qPCR mix购自大连宝生物工程公司;引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达 按照TRIzol说明书对所取组织进行RNA提取，并经紫外分光光度计测定A260/A280比值定量在1.8～2.0之间，以其为模板逆转录合成cDNA;MIF正向引物:5'-CCATGCCTATGTTCATCGTG-3'，反向引物为5'-GAACAGCGGTGCAGGTAAGTG-3';VEGF正向引物为:5'-ACGTCTGCGGATCTTGGACA-3'，反向引物为:5'-GGGCTGCTGCAATGATGAAG-3';所选内参为 β-actin，正向引物为:5'-CCAAGGCCAAC-CGCGAGAAGATGAC-3'，反向引物为:5'-AGGGTACATGGTGGTGGCGCCAGAC-3';RT-qPCR总反应体系为 25 μl，SYBR Green mix 12.5 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 8 μl，cDNA 2.5 μl，进行扩增并采用2－ΔCT计算mRNA相对表达量。反应条件:94℃ 3 min，1 个循环;94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，40个循环。

1.4 免疫组化染色 石蜡包埋组织4 μm连续切片，常规37℃烘烤30 min，后二甲苯、乙醇脱蜡、水化，3%过氧化氢溶液浸泡10 min，阻断内源性过氧化物酶活性。VEGF采用高温抗原修复20 min，MIF、CD31采用微波枸橼酸盐抗原修复，缓慢复温至室温水洗后PBS清洗3次，每次3 min，正常血清封闭15 min后加一抗(VEGF浓度为1∶400;MIF浓度为1∶400;CD31浓度为1∶500)，4℃过夜，PBS清洗3次，每次3 min。加生物素标记二抗，37℃孵育15 min，PBS洗涤3次，每次3 min;加DAB显色剂，苏木精复染，乙醇脱水，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。

1.5 结果判定 RT-qPCR完成后采用2－ΔCT计算mRNA相对表达量，并计算平均表达量。MIF和VEGF阳性型号均位于胞质内，细胞质、部分细胞膜、细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片在×400高倍视野下随机选择4个视野，计数阳性细胞数。“－”为不表达或者＜30%细胞表达，“+”阳性细胞数为30% ～50%，“”阳性细胞数为50% ～70%，“”阳性细胞数为＞70%。微血管密度(microvascular density，MVD)计数:先在低倍镜(×100)下选择出微血管最密集的区域，然后于高倍镜(×400)下计数5个视野的微血管数目，取平均值作为该病例的MVD值。所有切片均经3位病理医师在不清楚患者任何临床资料的情况下独立完成。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析，数据以±s表示，各指标与患者临床病理资料的关系采用独立样本t检验和χ2检验进行比较分析，各指标间的关系采用Spearman相关分析进行检测。

2 结果

2.1 MIF、VEGF mRNA的表达差异 实验结果显示MIF的PCR产物长度为368 bp，VEGF的PCR产物长度为380 bp，溶解温度较均一，峰形也较锐利。分析mRNA表达情况，其中膀胱癌组织中MIF、VEGF mRNA的平均相对表达量与正常黏膜组织比较差异均有统计学意义(P=0.002，P=0.008);浸润性癌组织中mRNA的表达量与表浅性癌组织比较差异有统计学意义(P=0.045，P=0.018)，见表1。

表1 MIF、VEGF mRNA的表达(±s)

表1 MIF、VEGF mRNA的表达(±s)

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2.2 MIF在BTCC组织中的表达 MIF阳性信号主要位于癌细胞胞质内(图1)，75例BTCC组织中，53例呈阳性，MIF阳性率为70.6%。12例正常膀胱组织中MIF阳性1例，阳性率为8.3%，差异有统计学意义(P=0.000)。伴有淋巴结转移的癌组织中MIF表达水平(20/21，95.5%)与无淋巴结转移的癌组织(33/54，61.6%)比较，差异有统计学意义(P=0.004)。随着BTCC临床分期的增高，MIF阳性率呈上升趋势，在浅表性和浸润性癌组织中阳性率分别为66%、80%，差异有统计学意义(P=0.209)。随着病理分级的增加，MIF阳性率分别为G1(53.6%)、G2(73.0%)、G3(90.4%)，且差异有统计学意义(P=0.018)。复发性癌组织中MIF阳性率高于初发性，差异有统计学意义(P=0.019)。MIF阳性表达率在性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤数量的患者之间，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

图1 BTCC及正常膀胱黏膜组织中CD31、MIF和VEGF的表达 SP×400

表2 MIF、VEGF表达与膀胱癌临床病理特征的关系

2.3 VEGF在BTCC组织中的表达 VEGF阳性信号主要位于癌细胞胞质中(图1)，75例BTCC组织中，46例癌细胞呈阳性，MIF阳性率为61.3%。12例正常膀胱组织中均无表达，差异有统计学意义(P=0.000)。伴有淋巴结转移的癌组织中VEGF表达水平(12/21，57.1%)与无淋巴结转移的癌组织(34/54，63.0%)比较，差异无统计学意义(P=0.642)。随着BTCC临床分期的增高，VEGF阳性率呈上升趋势，在浅表性和浸润性癌组织中阳性率分别为50%、76%，差异有统计学意义(P=0.031)。随着病理分级的增加，MIF阳性率分别为 G1(42.9%)、G2(65.4%)、G3(80.9%)，差异有统计学意义(P=0.022)。复发性癌组织中MIF阳性率明显高于初发性，差异有统计学意义(P=0.002)。VEGF阳性表达率在性别、年龄、肿瘤大小及数量的患者之间，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.4 MIF与VEGF的相关性 75例 BTCC组织中，两者均表达阳性的有38例，均无表达的有14例。采用Spearman秩相关分析后，两者在BTCC组织中表达呈正相关(rs=0.330，P=0.004)，见表3。

2.5MIF、VEGF与MVD的关系 实验结果显示MIF、VEGF阳性例数MVD值高于阴性例数，差异有统计学意义(P=0.000，P=0.001)，见表4。

表3 MIF与VEGF在BTCC中的表达(n)

表4 MIF、VEGF与MVD的关系(±s)

表4 MIF、VEGF与MVD的关系(±s)

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3 讨论

近年来，研究［1］表明MIF在肿瘤演变过程中发挥着重要作用，无论在肿瘤细胞增殖、分化、迁移还是肿瘤血管形成过程中都扮演着重要角色。Meyer-Siegler et al［3］发现膀胱癌细胞株 HT-1376 中存在MIF高表达现象;而通过对细胞加以外源性的MIF抗体或抑制剂后，其分泌受到抑制，同时该肿瘤细胞增殖明显减弱，这表明MIF可能在促进BTCC癌细胞的增殖过程中起重要作用。Liu et al［4］研究亦发现，MIF高表达与肿瘤的远处转移有关，经MIF抑制剂处理后肿瘤细胞的转移和侵袭能力明显降低。此外，相关研究［5－6］显示多种肿瘤中MIF的表达水平同P53蛋白、VEGF蛋白等的表达呈正相关，而这些蛋白均被认为在肿瘤的增殖、分化及血管形成等过程中扮演着重要角色。

本研究采用RT-qPCR、免疫组化方法分别检测MIF在BTCC中的表达情况，结果显示MIF在膀胱癌组织中的表达水平明显高于正常黏膜组织。通过对免疫组化染色结果进一步分析显示，MIF的表达水平在有淋巴结转移癌组织中明显高于无淋巴结转移组织，高级别明显高于低级别。这间接提示MIF蛋白在BTCC组织的生长、分化以及转移等生物学行为过程可能发挥着重要作用，高浓度的MIF有可能促进上述一系列过程的发生。目前，RT-qPCR结果显示MIF mRNA表达量在进展期癌组织中明显高于早期癌组织，而免疫组化则显示MIF蛋白表达水平与临床分期无关。因此，在BTCC组织中MIF mRNA的表达与MIF蛋白的表达并非完全一致，这一现象在许多基因中普遍存在［7］。

实体肿瘤的生长有赖于肿瘤新生血管的形成，并且肿瘤新生血管的形成也是其转移的病理生理基础。血管形成是一个非常复杂的过程，在此过程中需要诸多因素的参与，如VEGF、血管生成素、碱性成纤维生长因子(bFGF)及环氧合酶-2等，其中VEGF所扮演的角色最为重要，它能够与血管内皮特异性相结合，促进血管内皮细胞分裂增生、增强血管通透性，是作用最强的血管生成因子之一［8］。因此，其在肿瘤的生长、浸润及转移中起着重要作用。本研究RT-qPCR结果显示，癌组织中VEGF mRNA的平均表达量高于正常组织，且浸润性癌组织中mRNA平均表达量高于表浅性。免疫组化法结果显示在不同分期、分级的肿瘤组织中，VEGF的表达水平存在差异，即分化越低、分期越晚的肿瘤组织中其含量越高。且对于复发性癌组织，VEGF表达明显高于初发性，提示VEGF在BTCC复发时血管的形成和肿瘤发展同样具有重要作用;但VEGF表达水平与有无淋巴结转移无明显相关性。笔者推测，这与肿瘤细胞淋巴结转移机制相对复杂有关，单一因素并不能反映出其主要生物学特性，此外，本研究样本量相对较少也可能是影响因素之一。

在MIF表达阳性组织中，VEGF和MVD表达均明显增高，Spearman相关分析显示MIF与二者呈正相关关系。提示MIF可能促进BTCC组织中VEGF的表达，从而达到间接促进肿瘤组织微血管形成的作用。Cheng et al［6］在宫颈癌的研究中发现，MIF与其受体CD74的高表达能够增加VEGF的表达，并指出MIF在宫颈癌的肿瘤血管形成中扮演着重要的角色。Rubio et al［9］研究指出，肿瘤组织中 MVD可能成为淋巴结转移以及患者预后的一个新的指标。本研究显示MVD与淋巴结转移相关，而另一方面，MIF与淋巴结转移和微血管形成均成明显的正相关性。因此，MVD是否能够直接促进淋巴结转移尚不明确，可能为一个伴随关系，两者之间相互作用关系仍需进一步研究。

综上所述，MIF与VEGF的高表达且协同作用可能在BTCC的发生发展、浸润转移及复发方面具有重要作用，且MIF可能是影响BTCC肿瘤组织淋巴转移、微血管形成和VEGF表达的重要因素，进一步研究其作用机制可能成为BTCC分子靶向治疗中新的切入点。

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［3］Meyer-Siegler K L，Leifheit E C，Vera P L.Inhibition of macrophage migration inhibitory factor decreases proliferation and cytokine expression in bladder cancer cells［J］.BMC Cancer，2004，4:34.

［4］Liu H，Chen G，Zhang W，et al.Overexpression of macrophage migration inhibitory factor in adenoid cystic carcinoma:correlation with enhanced metastatic potential［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(2):287－95.

［5］庞国福，李解方，丁 平，等.P53和MIF在前列腺癌组织中的表达及临床意义［J］.南华大学学报，2008，36(4):452－4.

［6］Cheng R J，Deng W G，Niu C B，et al.Expression of macrophage migration inhibitory factor and CD74 in cervical squamous cell carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2011，21(6):1004 －12.

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［8］Kraizer Y，Mawasi N，Seagal J，et al.Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration［J］.Biochem Biophvs Res Commun，2001，287(2):209 －15.

［9］Rubio L，Burgo J S，Morera C，et al.Morphometric study of tumor angiogenesis as a new prognostic factor in nasopharyngeal carcinoma patients［J］.Pathol Oncol Res，2000，6(3):210 －6.