响应面法优化杏汁的微波杀菌工艺研究

严雅慧，黄文书，白羽嘉，冯作山

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

杏属蔷薇科，又名甜梅、杏子[1]。杏果中含有丰富的营养物质，如多酚、多糖、维生素、氨基酸和矿物质元素等[2]。杏是新疆的主栽果树之一，其栽培面积和产量均居全国各省（区）之首[3]，据2012年新疆统计年鉴[4]，杏果实产量为173.34万吨，占新疆水果总量的23.53%。杏汁就是新鲜杏果实经过挑选、清洗，榨出的汁液，是水果中最有营养价值的部分，其色泽艳丽、香味馥郁，甜味适度，新鲜爽口，容易被人体吸收，在风味和营养上接近于新鲜杏果。

热杀菌一直是杏汁加工的传统杀菌方法，其杀菌温度一般在90℃[5]以上，高温处理导致杏汁变味、变色及营养成分损失[6]。微波作为一种新的杀菌方式也开始应用于液态食品中，不仅具有低温、短时的特点[7]，还对食品营养成分和风味物质有更多的保留，同时对钝化酶和杀灭微生物也有较好的效果。

微波杀菌技术已广泛应用，一般具有以下特点：微波杀菌终止温度大多是85～158℃[8]；微波杀菌的起始温度是常温[9-10]；采用一次微波杀菌处理。与传统微波杀菌方法相比，本文的创新点是以杏汁为原料，控制杏汁微波终止温度不超过75℃，也同时降低杏汁微波杀菌的起始温度，再多次进行冷冻和微波交替处理，并选用Box-Behnken设计实验和响应曲面法分析实验结果，最终得到杏汁微波杀菌的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

轮台小白杏 新疆乌鲁木齐市北园春市场；平板计数琼脂 北京奥博生物技术有限责任公司；无菌生理盐水 浓度0.8%NaCl水溶液。

WD900B型微波炉 顺德市格兰仕电器实业有限公司；伟丰WF-A3000型榨汁机 永康市天歌电器有限公司；FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；NCJJ-0.1/100型纳米超高压均质机 廊坊通用机械有限公司；JM-L880型胶体磨 温州市七星乳品设备厂；HF-D88型封杯机 浙江省瑞安市宏福包装机械厂；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；超净工作台 上海鸿都电子科技有限公司；电子天平 上海越平科学仪器有限公司；LHS-150SC型恒温恒湿培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杏汁的制备 杏→挑选→清洗→去核→榨汁→胶体磨→纳米均质机→调pH→封装。

1.2.2 杀菌处理流程 研究微波杀菌处理对杏汁的影响。将100mL的杏汁置于260mL的塑料封杯中，用封杯机封口，再放在频率为2450MHz、额定功率为900W的家用微波炉的托盘正中央，微波处理一定时间，取出立即用温度计测量，控制杯内杏汁的微波终止温度最高温度不超过75℃。一次微波处理完后，杏汁置于冰柜中冷却至设定的起始温度后，再进行下一次的微波处理。

1.2.3 微生物菌落总数的测定 按《食品安全国家标准食品微生物学检验-菌落总数测定》[11]，采用平板倾注计数法进行菌落总数的测定，以无菌生理盐水适当稀释微波处理前后和未处理作为对照的杏汁，于平板计数培养基上在37℃培养48h，然后进行菌落计数。

根据GB 19297-2003果、蔬汁饮料卫生标准[12]中的微生物指标规定中，限定菌落总数（CFU/mL）≤100个，大肠菌群（MPN/100mL）≤3个，霉菌（CFU/mL）≤20个，酵母菌（CFU/mL）≤20个，致病菌都不得检出。致死率计算公式[13]：

式中，N0-冷冻处理后1mL杏汁中活菌数；N-微波处理后1mL杏汁中活菌数。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 杏汁的微波起始温度对细菌致死率的影响

用0.3%柠檬酸将已制备好的杏汁pH调至3.5，微波次数为3次，杏汁的微波终止温度为55℃，考虑到冷冻会使微生物的细胞大量脱水，导致蛋白质等生物大分子发生不可逆变性，还会在微生物细胞内形成冰晶体，对细胞产生机械破坏作用，从而导致微生物死亡的作用，故考察杏汁的微波起始温度降到零下，分别为-20、-10、0、10、20℃时对细菌致死率的影响，微波杀菌每一次的温度都要重新降至起始温度。

1.2.4.2 pH对细菌致死率的影响 将已制备好的杏汁的微波起始温度设为-10℃，微波次数为3次，杏汁的微波终止温度为55℃，考察pH分别为3、3.5、4、4.5、5时对细菌的致死率的影响，微波杀菌每一次的温度都要重新降至起始温度。

1.2.4.3 微波次数对细菌致死率的影响 用0.3%柠檬酸将已制备好杏汁pH调至3.5，杏汁的微波起始温度设为-10℃，杏汁的微波终止温度为55℃，考察微波次数分别为1、2、3、4、5、6次时对细菌的致死率的影响，微波杀菌每一次的温度都要重新降至起始温度。

1.2.4.4 杏汁的微波终止温度对细菌致死率的影响

用0.3%柠檬酸将已制备好杏汁pH调至3.5，杏汁的微波起始温度设为-10℃，微波次数为3次，考察杏汁的微波终止温度分别为35、45、55、65、75℃时对细菌致死率影响，微波杀菌每一次的温度都要重新降至起始温度。

1.2.5 Box-Behnken实验设计 在单因素实验基础上，根据中心组合实验设计原理，以微波杀菌的细菌的致死率（Y%）为指标，设计四因素三水平响应面分析实验，确定最优微波杀菌工艺参数。实验因素编码表如表1所示。

表1 响应面设计的因素水平及编码Table 1 Corresponding actual values of variables and coded values in response surface design

1.3 数据处理

每个处理重复3次，取平均值，数据以平均值±标准差的形式给出。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 杏汁的微波起始温度对细菌致死率的影响 杏汁的微波起始温度对细菌致死率的影响结果如图1所示。

图1 微波起始温度对细菌致死率的影响Fig.1 Effect of starting temperature of microwave on bacterial mortality rate

由图1可知，在杏汁的微波起始温度为-20～-10℃范围内，细菌致死率随着杏汁微波起始温度的升高而增大，-10℃时达到最大，随后又减小。可能是因为杏汁在-20～0℃冷冻过程中，冰晶体的形成不仅使微生物细胞遭到机械性破坏，使微生物细胞内原生质或胶体脱水，最后导致不可逆的蛋白质变性[14]，使得微生物的存活率迅速下降，从而增强了微波辐射处理对杏汁中微生物的杀灭能力。同时，微波非热杀菌效应与介质获取的微波能量有密切关系，在微波发生器输出能量恒定的条件，微波处理时间越长，介质获得的微波辐射能量越多，产生的杀菌效果就越好[15]，把杏汁的起始温度降到零下，可扩宽杏汁升温空间，延长杏汁的微波处理时间，使杏汁在低的杀菌温度下反复多次获得更多的微波辐射能，从而增强对微生物的杀伤作用。当微波起始温度0～20℃时，由于冷冻作用消失，微波终止温度不高，使得杏汁的微波处理时间缩短，获得的微波辐射能减少，所以致死率大幅度降低。

2.1.2 pH对细菌致死率的影响 pH对细菌致死率的影响结果如图2所示。

图2 pH对细菌致死率的影响Fig.2 Effect of pH on bacterial mortality rate

由图2可知，随着pH的增加，细菌致死率呈现出先增加后减小的趋势。微生物通常可以在一个较宽的pH范围内生长，但都有一个最适pH，但随着环境pH的不断变化，使得微生物继续生长受阻，当超过最低或最高pH时微生物就死亡[16]。在pH3.5时，微波杀菌效果最好，推测可能由于杏汁中大部分微生物的最适pH＞3.5，超出微生物生长的pH范围，使维持细胞内外pH动态平衡的氢离子泵功能受到严重破坏，影响细胞产能过程，细胞耗能得不到及时补充而致死[17]。

2.1.3 微波次数对细菌致死率的影响 微波次数对细菌致死率的影响结果如图3所示。

图3 微波次数对细菌致死率的影响Fig.3 Effect of microwave times on bacterial mortality rate

从图3能看出，当微波次数1～3次，随着微波次数的增加，细菌致死率也随之增加，当微波次数超过3次后，致死率无明显变化，可能是1～3次微波辐射处理，杀灭了杏汁中大部分由于反复冷冻使得细胞遭到机械破坏以及pH3.5已经超出能生长范围的微生物，超过3次后，有可能是因为把对微波辐射敏感的大部分微生物都杀死，之后残存的微生物对微波辐射不敏感。

2.1.4 微波终止温度对细菌致死率的影响 微波终止温度对细菌致死率的影响结果如图4所示。

图4 微波终止温度对细菌致死率的影响Fig.4 Effect of terminating temperature of microwave on bacterial mortality rate

由图4可知，随着杏汁微波终止温度的升高，细菌致死率增加，当杏汁的微波终止温度到65℃时，细菌致死率达到最大，超过65℃后，细菌致死率的升高幅度开始平缓。分析原因可能是微生物细胞在微波辐射场的作用下，其分子也被极化并作高频振荡，产生热效应，温度的快速升高使微生物蛋白质等生物大分子变性失活，细菌代谢异常，使菌体死亡或受到严重干扰而无法繁殖[18-19]，但超过65℃后，微波处理把大部分对电磁辐射敏感的微生物都杀灭，残存的是对辐射有一定耐受力的细菌，所以75℃的细菌致死率与65℃相比无明显变化。

2.2 响应面法优化微波杀菌条件的结果分析

根据单因素实验结果用Design-Expert 8.0.6软件统计，应用四因素三水平的Box-Behnken组合设计进行微波杀菌工艺的优化研究，选择微波起始温度、pH、微波次数与微波终止温度为自变量，以微波作用于细菌的致死率（Y%）作为实验指标，实验方案与结果如表2所示。

2.3 回归模型的建立及显著性检验

用软件Design Expert 8.0.6对表2中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值影响显著的各项，可得杏汁的微波起始温度、pH、杏汁的微波终止温度、微波次数与细菌致死率的多项回归方程，回归方程为：

对回归方程进行显著性检验、方差分析及各因素最佳值分析，结果见表3。

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟项检验和回归方程显著性检验。由方差分析表3可见，该模型p＜0.0001，表明该模型极显著；失拟项在α=0.05水平上不显著（p=0.1689＞0.05）。方程模拟的复相关系数R2=0.9922，修正相关系数R2Adj=0.9843，说明建立的模型能理解响应值变化的98.43%，表明此模型拟合度较好，回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系，该实验方法可靠。

由回归方程系数显著性检验可知，模型的一次项X1、X3和X4（p＜0.01）影响极显著，X2（p＞0.05）影响不显著；二次项（p＜0.01）影响均极显著；交互项X1X4（p＜0.01）影响极显著，X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4影响都不显著。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较可知，影响微波杀菌过程的因素作用大小为：X3＞X1＞X4＞X2，即杏汁的微波终止温度＞杏汁的微波起始温度＞微波次数＞pH。

表2 响应面分析实验设计及结果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

用Design Expert 8.0.6软件优化，分析得到微波杀菌的最佳工艺条件为：pH3.50，微波次数3.20，微波起始温度为-10.87℃，微波终止温度为67.02℃，此条件下细菌的致死率理论可达99.5644%。

2.4 因素间的交互作用

采用Design Expert 8.06软件分析并绘制相应的响应面图，如图5～图10所示。

图5～图10直观地反映了各因素对响应值的影响，比较6个图可知：微波终止温度（X3）对细菌致死率的影响最为显著，表现为曲线相对较陡；其次为微波起始温度（X1），微波次数（X4）、pH（X2）表现为曲线相对较为平滑，随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

2.5 验证实验

为检验实验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证实验。同时考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：pH3.5、微波次数为3次、微波终止温度为67℃、微波起始温度为-11℃。杏汁的原始细菌总数为9400CFU/mL，在修正后的工艺条件下进行3次平行实验，得到残存的细菌总数5个/CFU/mL，酵母菌3个/CFU/mL，大肠菌群、霉菌和致病菌都无检出，即微波对细菌的致死率是99.68%，比理论预测值99.5644%效果还好。因此，经响应面法优化所得的微波杀菌最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

图5 微波起始温度与pH对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.5 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and pH

图6 微波起始温度与微波终止温度对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.6 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave terminating temperature

图7 微波起始温度与微波次数对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.7 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave times

图8 pH与微波终止温度对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.8 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave terminating temperature

图9 pH与微波次数对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.9 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave times

3 结论与讨论

图10 微波终止温度与微波次数对细菌致死率交互影响的响应面分析图Fig.10 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave terminating temperature and microwave times

本实验通过单因素和Box-Behnken响应面实验，建立了模型，预测了微波的最佳杀菌条件：pH为3.5、微波次数为3次、微波终止温度为67℃、微波起始温度为-11℃。

在此条件下的杏汁微波杀菌工艺，微波辐射对细菌的致死率可达到99.68%，使得原始细菌总数为9400CFU/mL的杏汁经过微波杀菌工艺后，残余细菌总数5个/CFU/mL，酵母菌3个/CFU/mL，大肠菌群、霉菌和致病菌都无检出，得到杀菌后的杏汁不仅符合GB 19297-2003果、蔬汁饮料卫生标准，又由于微波处理杏汁的温度低，时间短，还能很好地保持杏汁原有的色泽、风味、营养和功效成分，所以该方法杀菌效果好，可用于生产高品质的杏汁产品。

本实验创造性地利用冷冻和微波的交替处理，有效杀灭杏汁中的各类酶活性和绝大多数微生物，达到商业无菌的要求，并且本实验中选用的响应值-细菌致死率（Y%），已经消除了冷冻对微生物的作用，更能精确的反映微波杀菌对微生物的影响。

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