高原习服过程淋巴细胞线粒体DNA含量及氧化损伤变化规律

薄 海，果凤春，段富强，彭 朋，秦永生

论著

高原习服过程淋巴细胞线粒体DNA含量及氧化损伤变化规律

薄 海1,2，果凤春3，段富强4，彭 朋1，秦永生1

目的观察世居平原男性青年高原习服各时程淋巴细胞线粒体能量代谢、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数及其氧化损伤的动态变化规律。方法27名世居平原武警新兵急进高原，分别在移居高原3、7、90 d检测淋巴细胞线粒体膜电位、mtDNA中8-oxodG含量、mtDNA拷贝数和PGC-1α蛋白表达。结果与平原阶段比较，移居高原3 d和7 d，膜电位显著降低(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷贝数和PGC-1α表达显著升高(P<0.05)；移居高原90 d，mtDNA拷贝数和PGC-1α表达显著降低(P<0.05)。移居高原90 d与移居高原7 d比较，膜电位显著升高(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷贝数和PGC-1α表达显著降低(P<0.05)。结论高原习服初期淋巴细胞能量重构主要依赖于线粒体数量增加，而在高原习服后期主要依赖于单个线粒体健康程度及能量代谢水平提高。

高原习服；淋巴细胞；线粒体DNA；拷贝数；氧化损伤

高原习服，是人类从低海拔地区进入高海拔环境后，机体为适应低氧环境发生的一系列提高低氧耐受能力的适应性变化。前期研究发现，久居平原武警新兵急进高原7 d，血氧饱和度即恢复至久居高原人群水平；移居高原90 d，心输出量明显高于急进高原7 d[1]。这表明在高原习服过程中，机体氧摄取和运输发生了明显的适应性变化。线粒体是细胞主要氧利用和能量合成场所。研究表明，急性高原低氧暴露抑制淋巴细胞线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性，降低线粒体呼吸速率[2]。罗勇军等[3]报道，平原汉族人群移居高原1年，白细胞线粒体DNA拷贝数显著高于平原人群。因此，可以认为线粒体数量和质量适应性变化是高原低氧习服的重要环节。本研究拟观察世居平原男性青年高原习服各时程线粒体能量代谢、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数及其氧化损伤的动态变化规律，并探讨其生物学意义。

1 对象和方法

1.1 对象 采取整群抽样法，选取同年招收的武警新兵中无进驻高原经历的青年男性27名为受试者，年龄(18.35±0.85)岁，身高(172.51±5.15) cm，体重(60.74±7.01) kg。所有受试者同批次由平原地区(成都，海拔约500 m)乘飞机直接到达高原地区(拉萨，海拔约3700 m)。

1.2 方法 参照《高原习服评价指标与方法》(国家军用标准GJB4301-2002)划分的习服进程[4]，分别在平原阶段、急进高原阶段(3 d)、高原初步习服阶段(7 d)和高原基本习服阶段(90 d)，抽取空腹静脉血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 淋巴细胞分离 抗凝血用PBS等体积稀释，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，800 g离心20 min，取淋巴细胞层，PBS洗涤两次，1000 g离心20 min，弃上清，收集淋巴细胞。留取部分细胞测定线粒体膜电位，其余细胞-20 ℃冻存。

1.4 淋巴细胞线粒体膜电位测定 采用JC-1荧光探针检测淋巴细胞线粒体膜电位[5]。操作严格按照试剂盒说明书进行(碧云天生物技术研究所)，将细胞加入0.9 ml JC-1染色工作液，加入3 μmol洋地黄皂甙透膜3 min。37 ℃避光水浴10 min。加入3 μmol苹果酸和8 μmol谷氨酸启动线粒体呼吸，荧光分光光度计测定红色荧光(激发波长525 nm，发射波长590 nm)与绿色荧光(激发波长490 nm，发射波长530 nm)。计算红色荧光数值/绿色荧光数值表示线粒体膜电位。

1.5 淋巴细胞mtDNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxodG)含量测定 按照试剂盒(Biovision)说明书提取并纯化mtDNA。高效液相色谱法检测mtDNA中8-oxodG含量。色谱柱采用粒径为4 μm的C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，流动相采用30 mmol氢氧化钠，10 mmol醋酸，25 mM醋酸钠，12.5 mM柠檬酸，6%甲醇，流速为0.8 ml/min，检测波长260 nm。8-oxodG标准品制备标准应用液，上述条件下绘制标准曲线。计算样品中8-oxodG含量(μg/ml)。

1.6 淋巴细胞mtDNA拷贝数测定 按照试剂盒(Biovision)说明书提取并纯化细胞总DNA。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测线粒体基因CytB及核基因18s rRNA的含量。引物序列：CytB上游，5′-CGGCTGACTAATCCGATACC-3′；下游，5′-TGGGAGTACATAGCCCATGA-3′。18s rRNA上游，5′-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3′；下游：5′-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3′。RT-PCR采用SYB-R Green master mix 试剂盒(ABI)，反应参数：94 ℃/5 s，58 ℃/30 s，循环40次。计算CytB与18 s rRNA含量的比值确定淋巴细胞mtDNA 的相对拷贝数。

1.7 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)蛋白表达 Western blot法检测淋巴细胞PGC-1α蛋白表达量，以β-tubulin作为内参。垂直电泳仪上用10 μg提取蛋白样品经15% SDS-PAGE分离，转移致PVDF膜上。一抗4 ℃孵育过夜，洗涤3次，再以1∶1000辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，充分洗涤后，使用ECL试剂盒发光显影，X线胶片压片曝光，扫描定量各条带相对灰度值。以平原组条带灰度值为100%，其灰度值与平原组条带灰度值的比值，即为其相对表达量(%)。

2 结 果

2.1 淋巴细胞线粒体膜电位及mtDNA中8-oxodG含量变化 与平原阶段比较，移居高原3 d和7 d，线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量显著升高(P<0.05)。与移居高原3 d比较，移居高原7 d和90 d，线粒体膜电位显著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量显著降低(P<0.05)。与移居高原7 d比较，移居高原90 d，线粒体膜电位显著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量显著降低(P<0.05，图1)。

2.2 淋巴细胞mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达的变化 与平原阶段比较，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达显著升高(P<0.05)，移居高原90 d，mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05)。移居高原90 d与移居高原3 d、7 d比较，mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。见图2。

图1 高原习服进程中淋巴细胞线粒体膜电位及mtDNA中8-oxodG含量的变化

图2 高原习服进程中淋巴细胞mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达的变化

3 讨 论

线粒体氧化应激是低氧损伤的重要机制。前期研究发现，急性低氧暴露显著增加线粒体电子漏，提高线粒体ROS生成速率[6]。mtDNA定位紧邻呼吸链ROS生成位点，且缺乏组蛋白和修复酶等保护机制，极易受到ROS攻击造成氧化损伤，mtDNA碱基被氧化修饰为8-oxodG。研究表明，如果DNA中8-oxodG不能有效清除，在复制过程中可引起G∶C-T∶A颠换突变；也可导致RNA聚合酶滑脱，在转录本中形成移码突变[7]。Ballinger等[8]发现，用H2O2孵育人脐带静脉内皮细胞，可导致mtDNA氧化损伤，并伴随由mtDNA编码的13个复合体亚基mRNA表达均降低，线粒体氧化磷酸化效率降低。以上表明，mtDNA氧化损伤程度与单个线粒体健康程度及能量代谢水平呈负相关。

本研究中，久居平原武警新兵移居高原3 d和7 d后，mtDNA中8-oxodG含量明显高于平原阶段，但7 d较3 d mtDNA氧化损伤有所降低。Ferro等[9]也发现，贫血造成的低氧血症可引起淋巴细胞ROS大量产生，导致mtDNA中8-oxodG含量增加，线粒体呼吸速率降低。Colleoni等[10]报道，人胎盘滋养层细胞低氧暴露4 d，mtDNA编码的复合体Ⅰ亚基ND1、复合体Ⅳ亚基COX2以及ATP合成酶亚基ATP6的mRNA表达显著降低。笔者利用细胞透膜的方法检测了淋巴细胞内线粒体整体膜电位，发现线粒体整体能量输出水平在移居高原3 d和7 d时明显低于平原阶段。总之，急进高原诱发的mtDNA氧化损伤是线粒体功能损伤的一个重要原因。

线粒体整体能量输出水平受到单个线粒体能量代谢水平和线粒体数量的共同影响。为了代偿低氧诱导的线粒体氧化损伤和能量代谢障碍，机体启动线粒体生物合成，以促进mtDNA复制和转录，增加mtDNA拷贝数和线粒体数量。PGC-1α是调控线粒体生物合成的重要转录因子。Gutsaeva等[11]发现，短暂缺血可提高线粒体ROS产生，继而通过活化p38 MAPK刺激PGC-1α介导的线粒体生物合成。本研究中，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷贝数和PGC-1α蛋白表达明显高于平原阶段，而线粒体整体膜电位虽在第7天有所恢复，但仍低于平原阶段。结果表明，在高原低氧习服初步阶段，急性低氧活化PGC-1α通路增加线粒体数量，但mtDNA氧化损伤造成新生线粒体能量代谢障碍，而ROS产生增加，进一步加剧氧化损伤，形成恶性循环，因而无法完全恢复受损的能量供应。

本研究中，移居高原90 d，mtDNA氧化损伤较7 d进一步降低，mtDNA拷贝数及PGC-1α蛋白表达低于平原阶段，而线粒体膜电位基本恢复至平原水平。Levett等[12]也发现平原人群移居高原19 d线粒体生物合成无明显变化，而66 d时线粒体生物合成明显降低。Gamboa等[13]证明，慢性低氧通过活化低氧诱导因子抑制PGC-1α介导的线粒体生物合成，但促进线粒体重分布于肌膜下，以提高毛细血管中氧向线粒体的扩散效率。本研究前期发现，慢性低氧可通过上调SIRT3提高线粒体呼吸速率，并增加线粒体抗氧化酶MnSOD和GPx活性[14]。笔者推测，随着低氧暴露时间延长，线粒体发生一系列适应性变化，包括抗氧化及DNA修复能力提高，mtDNA氧化损伤降低，单个线粒体健康程度及能量代谢水平升高，足以恢复细胞能量供应，因而减少了对线粒体数量的依赖性，这也符合生物节省化原则。

高原习服的一个重要因素是提高线粒体氧利用和能量输出效率，维持机体在低氧环境中的工作能力。本研究结果表明，高原低氧习服初期，淋巴细胞能量重构主要依赖于线粒体生物合成增加以提高线粒体数量，但不能完全恢复能量代谢水平；而在习服后期，淋巴细胞能量重构主要依赖于抑制mtDNA氧化损伤，提高单个线粒体健康程度及能量代谢水平，实现能量供应的完全习服。这为高原习服的评价及干预策略的开发提供了理论依据。

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(2014-01-26收稿 2014-05-20修回)

(责任编辑 郭 青)

ChangesincontentsofleukocytemitochondrialDNAandoxidativedamageduringacclimatizationtohighland

BO Hai1,2, GUO Fengchun3, DUAN Fuqiang4, PENG Peng1, and QIN Yongsheng1.

1.Department of Military Training Medicine; 2.Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury; 3.Department of Logistics Research, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China; 4.Department of Health, Tibet Autonomous Regional Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Lhasa 850000, China

ObjectiveTo study the changes in mitochondrial bioenergetics, mitochondrial DNA (mtDNA) and oxidative damage in leukocytes during acclimatization to highland hypoxia.MethodsTwenty-seven lowlanders quickly entered plateau. Leukocyte mitochondrial membrane potential, 8-oxodG in mtDNA, mtDNA copies and PGC-1α protein expression were measured in plain and plateau at 3 d，7 d，90 d after entry.ResultsAs compared with plain group, membrane potential was significantly decreased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly increased at 3 d and 7 d (P<0.05). And at 90 d, mtDNA copies and PGC-1α expression were significantly decreased (P<0.05). As compared with 7 d group, membrane potential was significantly increased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly decreased at 90 d (P<0.05).ConclusionsIn the early phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on increased mitochondrial content. In the later phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on elevated level of single mitochondrial health and energy metabolism.

acclimatization to high-altitude; leukocytes; mitochondrial DNA; copy number; oxidative stress

薄 海，博士，讲师，E-mail：bohaixd@126.com

300309天津，武警后勤学院：1.军事训练医学教研室，2.天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室，3.后勤工作研究所；4.850000拉萨，武警西藏总队后勤部卫生处

秦永生，E-mail：qinyongshengwj@126.com

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