维生素D受体基因多态性与新疆南疆地区维吾尔族小儿上尿路含钙结石易感性的关系研究

宋光鲁， 郭小丽， 孙 浩， 凯撒儿·阿吉， 安尼瓦尔·牙生， 王玉杰

(新疆医科大学第一附属医院泌尿中心， 乌鲁木齐 830054)

尿路结石是由基因、环境和激素等相互作用而引起的多因素疾病。伴随着现代分子生物学技术的发展及人们对尿路结石研究的深入，遗传基因对尿路结石形成的影响越来越引起众多研究者的关注。目前的研究显示，与尿路结石有关的维生素D受体(VDR)基因多态性位点较多，主要是限制性内切酶BsmI、ApaI、TaqI、FokI的酶切位点[1]。从人种学来说，汉族、蒙古族等属于蒙古人种，而维吾尔族、哈萨克族等属于高加索人种，不同的人种，VDR基因多态性的分布频率存在差异[2-3]。本研究采用PCR-RFLP及DNA测序技术，对新疆南疆地区的维吾尔族小儿上尿路含钙结石患儿的VDR基因多态性进行研究，探讨维吾尔族小儿患者VDR基因型频率分布特点及规律，试图揭示其与维吾尔族小儿上尿路结石发病的关系和遗传机制。

1 资料与方法

1.1研究对象选择2011年3月-2013年6月在新疆医科大学第一附属医院泌尿外科住院治疗的南疆地区维吾尔族上尿路结石患儿为病例组(n=89)，年龄6个月～7岁，男性57例，女性32例。所有患儿经CT、静脉尿路造影(IVP)和B超检查明确诊断为“上尿路结石”，常规行血尿液样本检查、血肝肾功能检查、血电解质检查。所有患儿结石样本进行红外光谱结石成分分析证明含有钙盐的成分。选择同期同一地区健康维吾尔族儿童作为对照组(n=121)，生活习惯和饮食习惯均相近，男性67例，女性54例，所有儿童无家族性结石病史，经泌尿系超声检查无尿路结石、肾钙化等异常病变，常规行血尿样本检查、血肝肾功能检查、血电解质检查。纳入标准：(1)尿路结石的诊断标准参考第9版《坎贝尔泌尿外科学》及第7版人民卫生出版社出版的《外科学》教科书，且均行CT、IVP和B超确诊为“上尿路结石”即“肾及输尿管结石”；(2)维吾尔族患儿及父母均出生于新疆南疆地区；(3)所有患儿的结石样本经分析为含钙成分的结石类型如草酸钙、磷酸钙、碳酸钙等。排除标准：(1)患有钙磷代谢有关其他疾病者如佝偻病、甲状腺功能障碍、甲状旁腺功能障碍者；(2)有临床表现的尿路感染并正接受治疗的患儿。(3)患尿路结石的患儿伴随有肾盂输尿管狭窄、肾功能不全、肾小管酸中毒症、肿瘤疾病、骨质疏松等。(4)补充维生素D及服用含钙成分的药品、补品等儿童。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会同意批准。抽血前均告知所有研究对象的合法家长并签署标本收取知情同意书。

1.2主要试剂红细胞裂解液、细胞核裂解液、蛋白沉淀液、DNA溶解液、1×TAE缓冲液、5×TBE缓冲液(北京百泰克生物技术有限公司生产)，外周血基因组DNA提取试剂盒(美国Gentra公司)，Agarose(美国sigma 公司)，EDTA(北京化学试剂公司生产)，内切酶(MBI Fermentas公司)，引物(上海生工生物公司)。

1.3方法

1.3.1 提取基因组DNA 抽取外周静脉血2 mL，用外周血基因组DNA提取试剂盒提取分离。DNA产物-80℃保存。

1.3.2 PCR 扩增 查Genebank数据库确定基因型及序列[rs:2228570,rs7975232rs731236]，VDR基因FokI酶切位点引物序列为：上游引物：5’-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3’，下游引物：5’-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3’；ApaI酶切位点引物序列为：上游引物：5’-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3’，下游引物：5’-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3’；TaqI酶切位点引物序列为：上游引物：5’-CTC AGT GAT CAC GAT ACT GTG-3’，下游引物：5’-ATT CAG TGG AAC CAG CGT TGG-3’。采用聚合酶链反应方法，扩增回收所需的DNA片段产物。

1.3.3 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 采集10 μL PCR产物分别加入2单位ApaI、TaqI、FokI内切酶，在37℃过夜进行内切后，经3%琼脂糖凝胶跑电泳，因酶切后的条带片段较小，且2个条带的距离较近，需低电压长时间跑电泳，保证条带充分分开。电泳初始进胶电压为100 V，持续电压为60 V，跑60 min,之后在紫外灯下观察及拍照记录。

1.3.4 结果鉴定 VDR基因的目的片段经相应内切酶内切以后电泳条带会出现3种情况：有内切位点的纯合子出现2个条带，以ff/tt/aa表示；没有内切位点的纯合子出现1个条带，以FF/TT/AA表示；杂合子出现3个条带，用Ff/Tt/Aa表示。

1.4统计学处理使用Microsoft Excel建立数据库，使用SPSS11.5软件分析数据。采用χ2检验分析等位基因频率、基因型频率和病例组与对照组之间基因型分布差异，P<0.05为差异有统计学意义。由Hardy-Weinberg定律可知，等位基因A1和等位基因A2的频率分别为p和q，(p+q)2=p2+2pq+q2=1，p2、2pq、q2分别为野生型、杂合型和变异型3种基因型的理论频率，并由此推算出其理论频数，并将理论数与观察数进行χ2检验。当P>0.05时，认为观察所得的基因频率符合Hardy-Weinberg定律，该基因多态性在人群中已达到遗传平衡，具有群体代表性。对病例组和对照组研究对象的性别和年龄进行χ2检验和t检验，当P>0.05时，该基因多态性在人群中已达到遗传平衡，具有群体代表性。

2 结果

2.1酶切后VDR基因的电泳结果VDR基因的FokI位点酶切后产生3种情况：265 bp 1个条带，以FF表示；196 、69 bp 2个条带，以ff表示；265、196和69 bp 3个条带，以Ff表示，见图1。

VDR基因的ApaI位点酶切后产生3种情况：1 700 、300 bp的2个条带，以AA表示；2 000、1 700和300 bp 3个条带，以Aa表示；2 000 bp 1个条带，以aa表示，见图2。

VDR基因的TaqI位点酶切后产生3种情况：495、245 bp的2个条带，以TT表示；495、290、245和205 bp的4个条带，以Tt表示；290、245和205 bp的3个条带，以tt表示，见图3。

图1 VDR基因FokI位点酶切后条带分布

图2 VDR基因ApaI位点酶切后条带分布

图3 VDR基因TaqI位点酶切后条带分布

2.2VDR基因的基因型和等位基因的频数分布

2.2.1 VDR基因型的Hardy-Weinberg遗传平衡检验 由Hardy-Weinberg定律可知，对VDR基因多态性中3个基因型观察所得的基因频率符合Hardy-Weinberg定律，该基因多态性在人群已达到遗传平衡，具有群体代表性，见表1。

2.2.2 病例组与对照组VDR等位基因的分布 在病例组和对照组的VDR基因多态性中，FokI的等位基因差异有统计学意义(χ2=15.040；P<0.001)，携带f等位基因的人群患上尿路含钙结石的危险性是携带F等位基因的人群的2.208倍(OR：2.208，95%CI：1.480～3.295)。病例组和对照组ApaI的等位基因A/a和TaqI的等位基因T/t差异无统计学意义(χ2=0.350，P=0.552；χ2=2.930，P=0.093)，见表2。

2.2.3 病例组与对照组VDR基因型的分布 在病例组和对照组的VDR基因多态性中，FokI的基因型差异有统计学意义(χ2=11.621，P<0.001)，携带Ff基因型和携带ff基因型的人群患上尿路含钙结石的风险有明显的增加(OR：1.084，95%CI：0.501～2.345；OR：4.259，95%CI：1.851～9.797)；病例组和对照组ApaI的基因型Aa、aa差异无统计学意义(χ2=0.287，P=0.592)，携带Aa基因型和携带aa基因型的人群无明显差异(OR：0.966，95%CI：0.497～1.878；OR：0.826，95%CI：0.410～1.664)；病例组和对照组TaqI的基因型Tt、tt差异无统计学意义(χ2=2.483，P=0.115)，携带Tt基因型和携带tt基因型的人群患上尿路含钙结石的风险无明显增加(OR：0.568，95%CI：0.293～1.101；OR：0.547，95%CI：0.258～1.158)，见表3。

2.2.4 病例组与对照组不同性别VDR基因型的分布FokI的基因型在男性患上尿路含钙结石患者中差异有统计学意义(χ2=8.497，P=0.004)，FokI的基因型Ff和ff的男性患上尿路含钙结石的风险较高(OR：0.984，95%CI：0.370～2.618；OR：4.846，95%CI：1.677～14.006)，FokI的基因型在女性患上尿路含钙结石患者中差异有统计学意义(χ2=3.230，P=0.072)；ApaI的基因型在男性和女性患上尿路含钙结石患儿中差异均无统计学意义(χ2=1.938，P=0.164；χ2=0.828，P=0.363)；TaqI的基因型在男性和女性患上尿路含钙结石患儿中差异无统计学意义(χ2=1.667，P=0.197；χ2=0.937，P=0.333)，见表4。

表1 VDR基因型的Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表2 病例组与对照组VDR等位基因的分布/例(%)

表3 病例组与对照组VDR基因型的分布/例(%)

表4 病例组与对照组不同性别VDR基因型的分布/例(%)

3 讨论

尿路结石是泌尿外科常见的一种疾病，也是世界上发病率较高的疾病，其人群患病率为1%～5%。通过各种结石分析方法的应用，人们发现在尿路结石中约有90%以上含有钙的成分，病因学的研究充分证实了尿路结石形成过程中体内钙的代谢异常是含钙结石的重要因素，因此影响体内钙的新陈代谢改变的因素都可能导致机体患结石病[4]。寻找正确的基因标记物对于监测和预防尿路结石有深远的影响。单核苷酸多态性(SNPs)作为绘制复杂疾病的工具的出现，使寻找引起结石疾病中钙离子新陈代谢异常原因的候选基因成为可能。其中含钙尿路结石的可能候选基因之一被认为是维生素D受体(VDR)基因、降钙素受体基因(CTR)和CaSR等，其中VDR基因对含钙尿路结石形成的影响越来越引起学者们的关注[5]。

VDR是一组类固醇受体家族，基因位于第12染色体上，大约全长5.6 kb。其为介导活性1,25-二羟维生素-D3发挥生物学效应的核受体，而许多不同的细胞内基因的转录调控着1,25-二羟维生素-D3的活性代谢产物。活性1,25-二羟维生素-D3激素信号分子与靶细胞核内的VDR结合形成激素受体复合物，后者再与靶基因特定的DNA序列结合，从而对结构基因的表达产生调节作用。维生素D在目标细胞的效果被维生素D的活性代谢产物和它的细胞内受体(VDR)的相互作用所调节。VDR在维持机体钙磷代谢等方面起着重要作用。在VDR基因中有几个基因多态性已被分离，它们在功能上明显的或潜在的在疾病易感性的效果也已经被查明[1]。

1999年Scott等[6]运用特殊的微卫星、核苷内切酶FokI和Tru91等技术发现位于维生素-D受体(VDR)基因的12q12-14位点与结石的形成有明显的关联性，认为VDR基因参与尿路结石的形成。有关研究通过对有遗传性高尿钙症的大鼠分析发现大鼠体内具有较高的VDR浓度水平与其结石的形成有密切关系[7]。2001年Chen等[8]报道在台湾人群中VDRFokI基因多态性与草酸钙尿路结石的形成有明显的关联性。Bid等[9]发现VDR中FokI基因多态性与草酸钙肾结石有明显联系。Bid等[10]和Mittal等[11]对健康和患尿路结石的印度儿童进行的研究结果显示，病例组与对照组维生素D受体基因FokI位点多态性分布有统计学差异，认为FokI基因多态性与印度儿童肾结石的形成有相关。但是Wang等[12]对464例汉族尿路结石患者及450例正常人群进行维生素D受体基因多态性分析，发现FokI基因多态性与含钙尿路结石的形成不存在相关性。Relan等[13]也报道维生素D受体BsmI和FokI基因多态性与尿路结石没有联系。王勤章等[14]对新疆南部地区90例维吾尔族尿路结石患者基因多态性研究的结果显示：对照组与病例组FokI酶切位点FF、Ff、ff 3种基因型频率差异有统计学意义(P<0.001)，其中维生素D受体基因FokI位点多态性将来可能成为尿路结石检测和筛选的一项指标。本研究发现病例组与对照组FokI的等位基因差异有统计学意义(P<0.001)，携带f等位基因的人群患上尿路含钙结石的危险性是携带F等位基因的人群的2.208倍(OR：2.208，95%CI：1.480～3.295)。说明FokI的等位基因F是避免人群患上尿路含钙结石的保护基因，而等位基因f是人群患上尿路含钙结石的易感基因。还发现病例组与对照组FokI的基因型差异有统计学意义(P<0.001)，携带Ff基因型和携带ff基因型的人群患上尿路含钙结石的风险有明显的增加(OR：1.084，95%CI：0.501～2.345；OR：4.259，95%CI：1.851～9.797)。FokI的基因型在男性患上尿路含钙结石患者中差异有统计学意义(P=0.004)，FokI的基因型Ff和ff的男性患上尿路含钙结石的风险较高(OR：0.984，95%CI：0.370～2.618；OR：4.846，95%CI：1.677～14.006)，FokI的基因型在女性患上尿路含钙结石患者中差异无统计学意义(P=0.072)。说明VDR的FokI基因多态性和维吾尔族小儿上尿路含钙结石的发病风险可能存在相关性，FokI基因多态性在不同种族的含钙尿路结石的形成中起着不同的作用，VDR的FokI基因可能作为筛选新疆维吾尔族小儿上尿路含钙结石的发病风险候选基因。

在目前的研究中，对VDR基因中ApaⅠ基因多态性与含钙尿路结石的形成是有争议的。Wang等[12]研究结果显示VDR基因中的ApaⅠ基因多态性与汉族含钙尿路结石的形成有密切关系，携带ApaⅠ的A等位基因的人群患尿路结石的风险是对照组的1.4倍。但是Nishijima等[15]报道在日本人人群中病例组和对照组VDR基因的ApaⅠ基因型无明显差异；病例组TaqⅠ的Tt和tt基因型的发生频率明显增高，并且TaqⅠ的t等位基因患含钙尿路结石的风险是对照组的5.2倍。Jackman等[16]的研究提出对于家族性含钙尿路结石的患者中有35% 表现为VDR基因中的TaqⅠTT基因型，并且携带TaqⅠTT基因型的患者在尿路结石发病和疾病进展等方面具有遗传性和结石复发高的特点。但是Gunes等[17]分别对110例结石患者和150例对照者通过PCR对基因多态区运用电镜放大分析了VDR基因中TaqⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ基因多态性区域，计算基因型和等位基因与尿路结石、家族病史以及结石复发等的关系，发现相邻的限制性内切酶片段长度多态性的单倍体结构在尿路结石患者中过度表达。但是，杂合子和纯合子携带者差异却无统计学意义，仅发现基因多态性和家族性尿路结石病史有联系。因此，他们认为VDR基因中TaqⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ基因多态性对尿路结石疾病的发生的危险性无意义。本研究结果显示，病例组和对照组ApaI的等位基因A/a和TaqI的等位基因T/t差异无统计学意义(P=0.552；P=0.093)，两组ApaI的基因型Aa、aa差异无统计学意义(P=0.592)；两组TaqI的基因型Tt、tt差异无统计学意义(P=0.115)，携带Tt基因型和携带tt基因型的人群患上尿路含钙结石的风险没有明显增加(OR：0.568，95%CI：0.293～1.101；OR：0.547，95%CI：0.258～1.158)。ApaI的基因型在男性和女性患上尿路含钙结石患者中均没有明显的统计学差异(P=0.164；P=0.363)；TaqI的基因型在男性和女性患上尿路含钙结石患者中没有明显的统计学差异(P=0.197；P=0.333)。说明维生素D受体(VDR)的TaqⅠ和ApaⅠ基因多态性和新疆维吾尔族小儿含钙上尿路结石之间可能不存在相关性，不能作为新疆维吾尔族小儿含钙尿路结石的筛选基因。这种维生素D受体(VDR)基因中等位基因多态性的表现频率的不平衡可能与种族不同有关。

总之，通过对新疆南部地区维吾尔族小儿尿路结石与维生素D受体基因多态性的研究显示：维生素D受体的FokI基因多态性与维吾尔族上尿路含钙结石有相关性，F等位基因是尿路结石的保护基因，f基因型则是尿路结石的易感基因，而VDR的ApaI和TaqI基因多态性与含钙尿路结石的发病风险可能不存在相关性。因此，维生素D受体的FokI基因多态性将来可能成为维吾尔族小儿上尿路含钙结石检测和筛选的指标。

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