正畸治疗的年轻恒牙和成熟恒牙的牙髓组织中VEGF水平比较

刘高成， 吴佩玲， 步 江， 白新华

(1乌鲁木齐市口腔医院口腔科， 乌鲁木齐 830002； 2新疆医科大学第二附属医院口腔科， 乌鲁木齐 830000)

牙髓是疏松的结缔组织，主要功能在于形成、营养、防御和修复牙本质，在修复过程中需要一系列生长因子介导。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是高度特异且具有多功能的细胞因子，不仅参与组织胚胎器官生长发育，还与炎症、创伤愈合和缺血性组织的修复再生有关。Janebodin等[1]报道人牙髓组织存少量VEGF，可诱导人牙髓细胞的趋化性能，促进牙髓细胞的增殖与分化，不同牙髓状态对VEGF的表达有影响。Matsushita等[2]报道动物VEGF表达呈增龄性，通过干预VEGF表达可达到治愈牙髓病的目的。目前有关VEGF 在人恒牙牙髓组织的表达的研究较少，本研究分析VEGF 在人年轻恒牙及成熟恒牙牙髓中的表达。

1 对象和方法

1.1研究对象收集2010年6月-2013年10月在新疆医科大学二附院口腔科行正畸治疗而需拔除的无龋健康的第一前磨牙56颗，包括年轻恒牙30颗和成熟恒牙26颗。年轻恒牙情况：牙根发育1/3～3/4，年龄6～18岁，男性20颗，女性10颗；成熟恒牙情况：年龄26～41岁，男性15颗，女性11颗。牙拔除后置于10%中性福尔马林固定液中固定，4℃下固定48 h。排除伴全身系统性疾病者、哺乳期或怀孕妇女、近2个月服用抗菌素和/或免疫制剂者。

1.2指标检测将固定的标本置于10%EDTA冲洗，采用脱钙液持续脱钙10 w，将脱钙的标本置于脱水机，脱水后浸蜡包埋，沿牙体中线自牙根向牙冠连续切片，每片厚4 μm[3]。采用常规免疫组化链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Srteptvadin-bitin Complex，SABC)法进行VEGF 抗体染色，PBS 缓冲液代替一抗为对照，DAB显色，中性树胶封片，4℃保存。以细胞质与基质染成斑点、颗粒或连续线状的黄棕色为VEGF阳性表达。

1.3评判标准将染色强度分为：0级(-)：未出现着色颗粒；Ⅰ级(+)：呈黄色，染色弱，高倍视野阳性细胞数<30%；Ⅱ级(++)：染色清晰，呈棕黄色或深黄色，高倍视野阳性细胞数>30%，利用图像分析仪和Meta Morph/Cool snapfx/AX70软件对阳性染色部位的透光强度(灰度值)定量分析。

2 结果

2.1年轻和成熟恒牙的VEGF分布与分布强度比较牙髓组织的VEGF 在成纤维细胞呈阳性，恒牙牙髓成纤维细胞的 VEGF 均呈阳性表达，但年轻恒牙的VEGF表达为强阳性，年轻恒牙牙髓中部呈强阳性表达，根部与冠部VEGF阳性表达明显较弱；成熟恒牙牙髓中部呈阳性表达，根部与冠部VEGF阳性表达明显较弱，见图1。

注: 1、2、3为年轻恒牙的牙髓冠部、中部和根部；4、5、6为成熟恒牙的牙髓冠部、中部和根部。

2.2VEGF在年轻和成熟恒牙不同部位的表达比较年轻恒牙牙髓成纤维细胞中的VEGF呈强阳性表达，向冠部和根部表达逐渐减弱；成熟恒牙牙髓成纤维细胞中的VEGF呈阳性表达，向冠部和根部表达逐渐减弱。与年轻恒牙比较，成熟恒牙牙髓成纤维细胞中的VEGF表达较弱，在冠部和根部的表达较弱，见表1。

表1 VEGF在恒牙的表达水平

3 讨论

牙髓(endodontium)是疏松的结缔组织，牙体组织中唯一的软组织，位于牙本质所形成的髓腔内，由细胞、纤维、血管、神经和淋巴等组成，牙髓细胞又称成纤维细胞，成纤维细胞呈星形，是牙髓的主要细胞，也是牙髓生物功能实现的主要物质基础，牙髓的主要功能为形成、营养、保护和修复牙本质[4]，其保护功能的实现需要一系列生长因子，如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等，其中VEGF是由牙髓细胞分泌且血管生成作用最强的因子，VEGF对提高血管的通透性、促使内皮细胞分裂、生成血管进而调节破骨细胞分化和增殖具有重要意义，其提高血管通透性的效能是组胺的5万倍[5-7]。

本研究显示，年轻恒牙的牙髓成纤维细胞中的VEGF呈强阳性表达，向冠部和根部表达逐渐减弱；成熟恒牙的牙髓成纤维细胞中的VEGF呈阳性表达，向冠部和根部表达逐渐减弱。与年轻恒牙比较，成熟恒牙的牙髓成纤维细胞中的VEGF表达较弱，在冠部和根部的表达较弱，与Matsuzaka等[8]和王青等[9]的研究结果相似。VEGF表达增强以及在年轻恒牙与成熟恒压中的表达不同有以下几方面意义：(1)正畸牙齿移动过程中，骨的改建是基于正畸牙移动，骨改建与血管改建关系密切，因此这个改建过程促使了牙髓的VEGF阳性表达，正畸牙的VEGF水平增高可促使血管的生成并提供丰富的血供与营养，募集破骨细胞，加快正畸牙移动，缩短正畸疗程，因此VEGF水平增高对牙髓修复具有重要意义[10]；(2)牙髓中VEGF 的表达还涉及多种机制的调控，如TNF-α、IL-6和TGF-α等多种细胞因子和生长因子，缺氧、机械或理化刺激等可上调VEGF-mRNA 表达，使 VEGF 释放到细胞外液，研究显示正畸过程中，牙周膜受压变窄，官腔受压变窄，压力区出现缺血缺氧，均导致VEGF表达增高[11-14]；(3)在牙齿发育的不同阶段，恒牙牙髓的VEGF水平不同，VEGF的功能发挥是通过识别Flt-1 或 Flk-1实现的，与成熟恒牙比，年轻恒牙 VEGF受体Flk-1的表达是成熟恒牙的1倍以上[7]，进一步说明年轻恒牙牙髓组织血管再生潜力高于成熟恒牙。因此增强 VEGF的表达、促进血管再生、诱导牙髓完全性修复牙本质的形成对于成熟恒牙的牙髓修复尤其重要，除了锉激根尖部出现凝血，还可将外源性 VEGF 和相关受体加入到支架和牙髓细胞的复合体中，或利用基因技术，将人 VEGF 及受体基因转入牙髓干细胞或成纤维细胞，使种子细胞持续产生VEGF 和相关受体，为修复性牙本质形成提供足够的血管化并调节细胞的活性，从而达到治愈牙髓病的目的[3,12-15]。

关于牙髓取材的方法，采用劈牙取髓法，固定时间短，牙体无须脱钙，切片和展片难度低，但该方法取得的牙髓组织有不同程度的破坏，根尖部破坏更明显，牙髓根尖狭窄部位在剥离时很容易断裂，镜下组织撕脱表现明显，而且劈牙取髓致使部分成牙本质细胞残留在髓腔壁。本研究采用牙体-牙髓联合切片法，可克服直接取髓法的的缺点，但有固定时间长、脱钙成本高和切片难度大等缺点。综合来看，两者均有优缺点，但从切片结果解读方面，牙体-牙髓联合切片明显优于直接取髓法，该法较好地保证牙髓组织的完整性，容易区分牙髓的冠根部和成纤维细胞，更有利于研究VEFG在牙髓组织的客观表达。

参考文献:

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