三维适形调强放疗对骨细粒棘球蚴生发细胞生长及凋亡影响的实验研究

徐江波， 孙俊刚， 袁 宏， 周文正， 赵喜滨， 王 浩， 徐万龙

(新疆维吾尔自治区人民医院骨一科， 乌鲁木齐 830001)

细粒棘球绦虫后绦幼虫棘球蚴寄生于宿主内的骨组织，称为骨囊性棘球蚴病，也称骨包虫病。目前骨包虫病的治疗主要包括手术治疗和药物治疗，但手术导致的骨包虫囊破裂可产生包虫扩散或过敏反应等严重并发症，而阿苯达唑在体内的低溶解性导致药物应用时间长，肝肾损害大等临床问题。根据三维适形调强放疗对肿瘤有很好的临床效果，部分学者推断其对骨包虫也具有很好的杀灭作用[1-2]。生发细胞是骨细粒棘球蚴包囊中最关键的生长细胞，是骨包虫分裂繁殖力最关键的细胞，是寄生虫发育、繁衍的最重要的部分，所以如果三维适形调强放疗对骨细粒棘球蚴生发细胞生长有抑制作用，并可促进其凋亡，则可为IMRT治疗骨细粒棘球蚴病的新方法提供直接的实验室证据。为进一步探讨IMRT对大鼠骨细粒棘球蚴生发细胞生长及凋亡的影响，本研究采用MTT法检测IMRT对鼠骨细粒棘球蚴生发细胞生长的抑制作用, 采用Hoechst 33258荧光染色观察生发细胞凋亡情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验细胞的选取及分组选用中国武警总医院实验动物实验室提供的骨细粒棘球蚴成年雄性大鼠10只。将骨包虫大鼠先行X线及CT检查，均提示骨继发性棘球蚴接种成功。骨细粒棘球蚴大鼠吸入麻醉后，显微镜下手术将骨细粒棘球蚴包囊取出，使用显微器械对内囊进行分离，眼科剪将其剪成小块，抗生素浸泡，胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶进行消化后离心，加入培养液后制成悬浊液后培养，待培养瓶壁可见单层细胞后，再次胰蛋白酶进行消化，配成骨细粒棘球蚴生发细胞悬浊液后备用。

将体外培养成功的骨细粒棘球蚴生发细胞分为IMRT放疗组及空白对照组。经CT扫描、靶区重建、计算系统对骨细粒棘球蚴生发细胞悬浊液的放射剂量及剂量分布均匀程度按照放疗计划进行分析和计算后，由专业放疗物理师对IMRT放疗组给予总剂量为40 Gy的IMRT放疗，空白对照组只给予假照射作为阴性对照。

1.2MTT法于放疗结束24 h后,采用MTT法检测IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞生长的抑制作用。将两组骨细粒棘球蚴生发细胞的悬浊液置入培养板内，将培养板的孔道内加入MTT 溶液，继续培养，弃除上清液后，再加入DMSO液，待晶体全部溶解后，应用酶联免疫检测仪检测490 nm 波长处各孔道吸光度OD的平均值。

1.3Hoechst33258荧光染色法于放疗结束24 h后,采用Hoechst 33258荧光染色观察IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞凋亡的影响。将两组骨细粒棘球蚴生发细胞的悬浊液分别放置于Eppendorff管中, 分别加入Hoechst 33258荧光染料，并将其浓度配比至10 mg/L、PI 50 mg/L, 室温下染色后将处理过的骨细粒棘球蚴生发细胞悬浊液铺于载玻片上，紫外线进行照射, 细胞被激发后的效果经荧光显微镜观察、照相。

2 结果

2.1MTT法检测IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞生长的抑制作用未接受放疗的空白对照组的代表骨细粒棘球蚴生发细胞生长增殖的吸光度OD值为(0.792±0.098)，远高于IMRT放疗组的骨细粒棘球蚴生发细胞生长吸光度OD值为(0.213±0.070)，且差异有统计学意义(P<0.05)，提示IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞的生长具有明显的抑制作用。

2.2Hoechst33258荧光染色观察IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞凋亡的影响未接受放疗的空白对照组的骨细粒棘球蚴生发细胞荧光显微镜下观察显示染色弥散均匀, 呈淡蓝色的为正常细胞胞核(图1); 而IMRT放疗组的骨细粒棘球蚴生发细胞呈致密浓染的强蓝色荧光为凋亡细胞的细胞核,凋亡细胞的胞核固缩, 染色质凝集, 边缘化(图2)。

图1 空白对照组Hoechst 33258荧光染色结果

图2 IMRT放疗组Hoechst 33258荧光染色结果

3 讨论

细粒棘球蚴病又称包虫病，属于全球性发病的一种危害严重的人兽共患病[3]，我国是该病的重灾区，在我国主要流行性发病于新疆、青海、甘肃、四川、宁夏、内蒙古和西藏等地，高发区面积占全国的40%以上[4]。陆家海等[5]对新疆部分地区从事畜牧业人员感染的调查显示，包虫病感染率为 3%～32%，患病率为 1.4%。目前，我国包虫病现症患者 50 万～60 万，受威胁人口约 5 千万，其中骨包虫约占100万[4]。

对于骨细粒棘球蚴病的治疗，临床上手段有限，在仅有的临床手段中手术治疗仍作为首选，但由于骨松质的存在，一次手术很难彻底清除深藏于骨松质之内的骨细粒棘球蚴头节等，除非创伤较大的截肢手术。而且手术极易导致骨细粒棘球蚴囊壁的破裂，导致疾病的蔓延、扩散，囊液会造成术中严重的休克反应甚至死亡。而对那些身体器官不能耐受手术打击的患者，苯并咪唑类药物便是临床上可供选择治疗的手段。但由于肝脏屏障、骨屏障、细粒棘球蚴囊壁屏障的存在，到达包囊内的药物浓度极低，因此必然造成药物服药时间长、治愈率低、复发率高。

三维适形调强放疗(intensity modulated radiationtherapy，IMRT)治疗肿瘤的原理是利用IMRT加速器产生的射线高能穿过组织时，在射线轨道上将射线的能量传送至靶区的组织细胞，通过直接破坏作用，或者组织间自由基之间的间接作用，使得靶区的组织细胞的DNA结构发生改变，产生DNA结构中的单链结构、双链结构发生断裂，从而导致靶区组织细胞的变性或坏死。IMRT是通过计算机来控制射线的方向，可将精确的、剂量高的射线集中在医者所关心的病变组织区域，而周围组织很少受到射线的损伤，所以IMRT是现有临床上一种可靠、精度高的放射治疗方法，受到学者的推崇。根据IMRT对肿瘤细胞有很高的杀灭作用，所以笔者认为IMRT对骨细粒棘球蚴的生发细胞生长及凋亡均有很大的影响。

本研究通过对体外培养的骨细粒棘球蚴的生发细胞实施IMRT，参考临床良性肿瘤的放疗剂量，给予骨细粒棘球蚴靶区总剂量为40 Gy的IMRT放疗，而空白对照组只给予假照射作为阴性对照。于放疗结束24 h后,采用MTT法检测IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞生长的作用, 结果未接受放疗的空白对照组的代表骨细粒棘球蚴生发细胞生长增殖的吸光度远高于IMRT放疗组，提示IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞的生长具有明显的抑制作用。而Hoechst 33258荧光染色观察IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞凋亡影响的结果提示，未接受放疗的空白对照组的骨细粒棘球蚴生发细胞荧光显微镜下观察显示染色弥散均匀, 呈淡蓝色的为正常细胞胞核，提示生发细胞未产生凋亡；而IMRT放疗组的骨细粒棘球蚴生发细胞呈致密浓染的强蓝色荧光为凋亡细胞的细胞核,凋亡细胞的胞核固缩, 染色质凝集, 边缘化，提示IMRT促进或导致了骨细粒棘球蚴生发细胞的凋亡。

本研究结果表明，当IMRT总剂量达到40 Gy时，IMRT对鼠骨细粒棘球蚴生发细胞生长有抑制作用，并可促进其凋亡，初步证明了IMRT对骨棘球蚴病有很好的治疗效果。但是，本研究属于病理生理环境相对简单的体外细胞的初步实验，所以欲将本研究的结果推广到临床，还需要进一步的动物体内试验及人体临床研究。

参考文献:

[1] 徐万龙，缪晓刚，塔依尔江·举来提，等. 三维适形调强放疗对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的影响[J]. 中国实用医刊, 2012, 39(18):41-43.

[2] Xu WL, Xilinbaoleri, Liu H, et al. Spinal cord biological safety of image-guided radiation therapy versus conventional radiation therapy[J]. Neural Regenerat Res, 2012, 7(35):2755-2760.

[3] Otero-Abad B, Torgerson PR. A systematic review of the epidemiology of echinococcosis in domestic and wild animals[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(6):e2249.

[4] Wang K, Zhang X, Jin Z, et al. Modeling and analysis of the transmission of Echinococcosis with application to Xinjiang Uygur Autonomous Region of China[J]. J Theor Biol, 2013, 333(10):78-90.

[5] 陆家海，郭中敏，余新炳，等. 细粒棘球蚴细胞系培育及其免疫研究[J]. 中山医科大学学报, 2001, 22(2):81-84.