高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中香兰素及衍生物

黄晓林，宋戈

(1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆163000；2.东北农业大学 国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨150028)

0 引 言

香兰素是一种合成香精，通常分为香兰素和乙基香兰素，还有邻位香兰素，具有香荚兰香气及浓郁的奶香。人体大量摄入香兰素等食品添加剂会导致头晕、恶心、呕吐,还会影响肝脏、肾脏的功能[1]。食品添加剂使用标准[2]中明确规定规定了较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素使用限量,婴幼儿谷类辅助食品中也可以使用香兰素，但0至6个月婴幼儿配方食品不得添加任何食用香料。目前，尚无婴幼儿配方食品中香兰素及衍生物的官方检测方法，文献报道的测定方法有高效液相色谱法[3]、气相色谱[4-5]、液相色谱-质谱联用法[6-8]等，这些方法或灵敏度低，或操作繁琐，或对设备要求高。本文采用高效液相色谱紫外检测法同时测定了婴幼儿配方食品和乳粉中香兰素及衍生物的含量,方法简单、快速,灵敏度高，重现性好，在实际样品应用中得到了满意结果。

1 实 验

1.1 仪器设备

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，酸度计,漩涡振荡器,超声提取仪。

1.2 试剂

香兰素、乙基香兰素和邻位香兰素标准品(≥98%)，用乙腈配置成质量浓度为1.0 g/L的储备液，使用前用水稀释到所需的质量浓度；乙腈，甲醇均为色谱纯；磷酸二氢钾，醋酸铵等均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，柱温为20℃；检测器为紫外检测器；测定波长为276 nm；流动相为浓度0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=4.0)-乙腈(体积比为75∶25)；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。

1.3.2 样品处理

谷类辅助食品：称量2～4 g到三角瓶中，加入0.5 g淀粉酶和40℃以下的水25 mL，在37℃的培养箱中培养30 min。乳粉：称量2～4 g到三角瓶中；加入40℃以下的水25 mL溶解，旋涡振荡1 min，冰水浴超声10 min；然后用盐酸溶液调pH值至1.7,用氢氧化钠调pH值至4.5，定容到50 mL，摇匀后用滤纸过滤，吸取10 mL滤液到三角瓶中，用氢氧化钠溶液调pH值至7，分多次洗入已经活化过的MAX固相萃取柱,依次用5%氨水3 mL、甲醇3 mL淋洗,再用4%甲酸甲醇溶液3 mL洗脱,在40℃下吹干后用流动相定容到1 mL,旋涡振荡溶解后用0.45 m滤膜过滤,供分析测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

在满足分离效果，达到待测物质与杂质基本分离的条件下，应选择能改善待测物质的响应，提高灵敏度的流动相。通过试验发现乙腈-磷酸盐溶液作流动相时待测物质分离度和灵敏度比甲醇-磷酸盐溶液作流动相时高，而且系统压力小。本实验还考察了乙酸铵、硫酸铵和柠檬酸铵等溶液作为缓冲溶液时对分离测定的影响，结果显示，乙腈-磷酸盐溶液作流动相时分离效果和待测物质灵敏度都比较理想。另外通过改变流动相中缓冲溶液的浓度与pH值比较被测组分的色谱峰和分离度，确定流动相的缓冲溶液的浓度与pH值。当磷酸盐溶液的浓度为分别为0.01，0.02，0.05，0.10 mol/L时，对分离影响不大，但随着磷酸盐溶液浓度的增加，待测物质的出峰时间愈稳定，考虑到缓冲盐浓度增大，对色谱柱及系统管路造成的损害也会加大，所以选择浓度为0.05 mol/L的磷酸盐溶液作为缓冲溶液。调节浓度为0.05 mol/L磷酸盐溶液pH值分别为 5.0，4.5，4.0，3.5，3.0；随着磷酸盐溶液pH值的降低，峰形越来越对称而且尖锐，重复性也越来越好，考虑到色谱柱的耐酸程度，调节浓度为0.05 mol/L磷酸盐溶液pH值为4.0较为合适。为了缩短分析时间，通过试验最终确定浓度为0.05 mol/L磷酸盐溶液与乙腈的比例为75比25。标准样品、含香兰素及其衍生物样品、空白样品的色谱如图1～图3所示。按出峰顺序依次为甲基香兰素、乙基香兰素和邻位香兰素。

图1 标准样品的色谱

图2 含香兰素及其衍生物样品的色谱

图3 空白样品的色谱

2.2 前处理的选择

前期处理的选择与后期固相萃取净化浓缩息息相关。除去样品中蛋白质和脂肪的方法有很多，例如用亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂，用有机试剂甲醇和乙腈沉淀，加入碱和硫酸铜沉淀，用酸碱调节pH沉淀等等。进行样品的净化时，样品溶液的pH值要大于香兰素及其衍生物的pKa两个单位，使其以阴离子的形式存在，上样时才能萃取柱被保留。前期处理时选择用亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂或加入碱和硫酸铜沉淀样品中的蛋白，过滤后取部分滤液调整pH值到7时，有沉淀出现影响萃取净化；而用有机试剂甲醇和乙腈沉淀，取部分滤液调整pH值到7后上样由于溶液中有机相比例大，会穿透萃取柱，造成被测物流失。用酸碱调节pH沉淀样品中蛋白的前处理是后期混合型强阴离子交换固相萃取净化较好的选择。

2.3 固相萃取的选择与优化

由于婴幼儿配方食品和乳粉中各种成分复杂，其中水溶性成分的干扰目标物检测的杂质繁多，用普通的C18固相萃取，很难将杂质净化干净。香兰素及其衍生物均带有酚羟基，是弱酸性有机化合物，易失去 H+而变成阴离子，混合型强阴离子交换固相萃取对该类化合物具有更高的选择性。上样后一些杂质也被保留下来，为了达到净化的目的，必须把这些杂质除去。在把这些杂质除去的时候，不让被测组分流失，先用碱性溶液冲洗萃取柱，让被测组分全部以阴离子的形式存在，更好地被保留。而碱性溶液浓度不能太大，碱性也不能太强，否则会适得其反，故选择了5%氨水溶液。再用甲醇淋洗，由于被测组分与萃取柱中的固定相因离子间的相互作用而被保留，大部分脂溶性的杂质就被洗脱除去了。要将被测组分从柱子上洗脱下来，得用酸性比被侧组分强的溶液。为了便于浓缩吹干，选用甲酸甲醇溶液进行洗脱，将能中和分析物的电荷，使之从固相萃取柱上脱离下来。甲酸的浓度越大，洗脱效率就越高，但越不便于浓缩吹干。经试验5%甲酸甲醇溶液洗脱效率最高，而且也容易浓缩吹干，保证了回收率。

2.4 方法的线性及检出限

分别配制不同浓度的标准混合溶液，在最佳色谱条件下，进行了标准曲线的测定，得到4种化合物的回归方程及线性相关系数、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了检出限，如表1所示。

2.5 方法的回收率及精密度

以同一个乳粉样品为试验材料，加入一定量的香兰素及其衍生物的标准溶液，进行回收试验，每个样品平行测定3次，以平均值计算回收率，回收率结果如表3所示。

表1 线性关系与检出限

表2 方法的回收率(n=3)

另外以同一个乳粉样品为试验材料，添加了0.3 g香兰素，0.5 g乙基香兰素，0.8 g邻位香兰素，平行测定8次，测定结果的精密度 (n=8)分别为:香兰素2.53%。乙基香兰素2.09%，邻位香兰素4.18%(均为质量分数)。由此可见，测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。

3 结 论

本文重点研究和优化了流动相和固相萃取条件，建立了高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中香兰素及衍生物的方法。该方法测定结果重现性好，灵敏度高，简单易操作，适合婴幼儿配方食品和乳粉中香兰素及衍生物的日常检测。

[1]NI Y N,ZHANG G W,KOKOT S.Simultaneous Spectrophotometric Determination of Maltol,Ethyl Maltol,Vanillin and Ethyl Vanillin in Foods by Multivariate Calibration and Artificial Neural Net-works[J].Food Chem,2005,89:465-473.

[2]GB 2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[M].北京:中国标准出版社,2011.

[3]金海涛,马健瑜,王晓珣,等.高效液相色谱法同时测定香兰素与邻位香兰素[J].分析测试学报,2011,30(2):222-224.

[4]林灵超,吴方圆.高效液相色谱法同时测定牛奶中的香兰素与乙基香兰素[J].化学分析计量,2013,22(2):60-62.

[5]刘玉萍.婴幼儿乳制品中香兰素的检测方法研究[J].湖南文理学院学报(自然科学版),2011,23(2):51-54.

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[7]罗冠中,刘祥,孟云彩.液相色谱串联四极杆质谱法同时测定婴幼儿配方食品中甲基香兰素和乙基香兰素 [J].分析试验室,2011,30(8):84-87.

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