乳制品中蜡样芽孢杆菌的研究进展

赵月明，任国谱

(1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，长沙410004；2.湖南省亚华乳业控股有限公司中心实验室长沙410004)

0 引 言

蜡样芽孢杆菌是一种无荚膜，能运动，产芽孢，兼性好氧的革兰氏阳性杆菌。蜡样芽孢杆菌可产生致吐、致腹泻的肠毒素,人在食用被蜡样芽胞杆菌污染的食品后,一般在8～16 h内出现呕吐或腹泻,或两者兼有的中毒症状[1]。偶尔能导致眼部感染，心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病[2]。 因为蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以无法避免地会污染食品[3]。原料奶的污染来源主要有奶牛的粪便、饲料，水和土壤，其次是奶罐和加工场的机械管道。产生肠毒素的蜡样芽孢杆菌菌株已经从许多种食品中分离出来,在原料乳中分离的83株菌中有85%是致腹泻毒素阳性菌株[4]。在乳品行业，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒极可能被误认为是乳糖不耐症而被忽视。本文概述蜡样芽孢杆菌的检测方法及其在乳制品中的污染情况，为追溯其污染情况源及建立相应防控措施提供理论依据。

1 蜡样芽孢杆菌对乳制品的污染情况

乳制品在加工、运输、储存等环节均易受蜡样芽孢杆菌污染，该菌可以通过泥土、灰尘、昆虫、不洁用具和从业人员的手而传播，研究表明食品中蜡样芽孢杆菌污染程度为104CFU/mL时就会对人体造成潜在的健康威胁从而不适于消费者食用[5]，当菌落含量超过105CFU/mL时，就有可能爆发食物中毒事件[6]。在1986～2007年发生的227起蜡样芽孢杆菌呕吐型食物中毒事件，有2.6%是由乳及乳制品引起的，34起腹泻型食物中毒事件5.9%是由乳及乳制品引起的[7]，这其中不包括被误当做乳糖不耐症而被忽视的。婴幼儿免疫功能低，叶红萍[8]曾报道1例试用婴幼儿配方奶粉引起的腹泻检出蜡样芽孢杆菌，其菌落总数为160CFU/g,远低于105CFU/mL，亦能致病。其中有2起是婴儿奶粉和2起利乐包包装的椰子奶。

近年来国内有关乳制品中蜡样芽孢杆菌的研究和检测主要集中在原料奶和婴幼儿配方奶粉，其污染情况的部分研究如表1所示。

2 蜡样芽孢杆菌的检测方法

2.1 常规鉴定方法

传统检测方法是将分离培养后的可疑菌落做生化反应试验，溶血试验，协同溶血试验，动物试验，典型运动等鉴定，被确定为蜡样芽孢杆菌后进一步进行血清分型。目前我国常用的蜡样芽孢杆菌的检验方法是国标法GB 4789.14-2003，以及行业标准SN/T 0176-1992(进出口食品蜡样芽孢杆菌检验方法)和SN/T 255211-2010(乳及乳制品微生物学检验方法)。常规检验步骤为[19]：样品→增菌→分离培养(并作菌数测定)、分离纯化→革兰染色镜检/生化及菌落观察/生化反应试验→肠毒素检查。这种方法费时、费力，而且需要较长时间进行选择性增菌过程[20]。

目前检测方法中常用的选择性培养基主要有蜡样芽孢杆菌选择琼脂(PEMBA)、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基 (MYP)，显色培养基主要是BCM。PEMBA已经是国际化标准组织(ISO)公认的检验蜡样芽孢杆菌的选择性培养基，主要用于临床样本。MYP广泛用于蜡样芽孢杆菌的分离和计数。BCM和MYP相比菌落技术和分离更容易，有较高选择性，能形成离散的不连在一起的菌落[21]。

表1 乳制品中蜡样芽孢杆菌污染情况

2.2 快速检测方法

2.2.1 PCR法

(1)普通PCR方法

Tsen等[22]设计了16S核糖体RNA的引物，以此为基础建立PCR来定量检测。王振国等[23]通过扩增致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测。

ELSE M F等[24]建立了实时PCR检测蜡样芽孢杆菌的方法；王振国等[25]利用SYBR Green I染料能与双链DNA结合发出荧光的特点，开发出一种用来检测致病性蜡样芽孢杆菌的实时PCR方法；王红等[26]建立实时荧光PCR检测蜡样芽孢杆菌以及溶血素HBL和非溶血素NHE。

普通PCR电泳法和实时荧光PCR法比较结果如表2。

表2 普通PCR与荧光PCR比较

利用PCR技术对食品中的蜡样芽孢杆菌的检测较常规方法具有省时省力的特点且灵敏性较高，具有较高的实际应用价值。但这些方法的缺点是不能特异性检测到靶生物，不能检测到所有的从食品中分离的蜡样芽孢杆菌，灵敏度低。蜡样芽孢杆菌形成的芽孢也给PCR检测带来了不便。多数情况下都需要将菌在适合的培养基上培养8～15 h后，大大延长了检测时间[27]。

与常规PCR电泳方法相比，实时荧光PCR无须电泳，与其他非致病蜡样芽孢杆菌及其他菌株均无交叉反应，可以直接对扩增产物进行检测，缩短了检验时间，且可避免扩增产物对实验室的污染，具有较强的应用价值。但该法容易导致假阳性结果，对引物要求较高，检验成本也较高[23]。

Hikmate Abriouel等[28]用 重 复 序列引物聚合酶链反应 (repetitive element sequence-based PCR)和16S rDNA顺序序列分析的方法来区分同源关系的蜡样芽孢杆菌组.

Eulyoung Choo等[29]设计出多重PCR快速鉴定蜡样芽孢杆菌的方法；蒋培余等[30]通过设计引物和探针，优化反应条件，建立多重实时PCR，检测蜡样芽孢杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因 (编码致呕毒素cereulide)与菌株鉴定结果的符合率为100%，ces基因检测结果与普通PCR结果相符。李洋洋等[31]建立了同时检测婴幼儿奶粉中坂崎杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法。

黄训端等[32]利用VITEK自动鉴定系统鉴定草莓蜡样芽孢杆菌,与分子生物学的验证后结果一致，表明VITEK的可靠性和准确性。赵宁等[33]针对目前原料乳中蜡样芽孢杆菌检测方法的繁琐、费时、耗力，建立了一种操作简便的快速检测方法，采用过滤富集菌体后PCR技术来检测原料乳中蜡样芽孢杆菌。整个过程只需6 h左右即可完成，检测灵敏度高达10 CFU/mL这种方法是对传统检测方法的有效改进，并且达到了原料乳检测快速、准确、灵敏的要求。

2.2.2 环介导等温扩增技术

齐哲[34]开发了环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。该法以蜡样芽孢杆菌溶血素基因的hblA基因的保守序列设计引物，将FTA滤膜提取DNA与LAMP法相结合，检测蜡样芽孢杆菌和人工污染蜡样芽孢杆菌的消毒乳。LAMP方法检测灵敏度高，蜡样芽孢杆菌的检出限为4.4 mL-1，比PCR检测灵敏度高10倍；人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检出限57 mL-1。LAMP扩增可在20 min内完成，对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测 (包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2 h内完成.该方法灵敏度高、特异性好、耗时短。

2.2.3 PCR—DHPLC法

郑秋月等[35]应用PCR结合变性高效液相色谱技术对食品中污染的蜡样芽孢杆菌进行快速准确的检测。该法是根据蜡样芽孢杆菌gyrB特异基因序列的特点设计特异性引物，PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。结果表明该方法具有很高的特异性，灵敏度高，检出限可达10 mL-1，快速简便。

2.2.4 微生物专用酶快速反应系统的检测技术

张淑红等[36]利用特异性酶法鉴定致病菌的特点，设计了一种用来检测食品中蜡样芽孢杆菌的显色快速检测方法。该法利用特异性酶反应原理，设计了蜡样芽孢杆菌显色培养基(HKCB)，通过人工污染样品和实际样品检验，分析，结果表明显色培养基HKCB与传统平板MYP可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有较高的特异性。

2.2.5 免疫学方法

检测蜡样芽孢杆菌肠毒素的免疫学方法主要有免疫乳胶凝集试验、反向简介凝血试验、反向被动乳胶凝集试验、放射免疫法、免疫荧光技术、酶联免疫测试技术及免疫印迹法等。CHEN CH等[37]报道了用蛋白印记技术(Colony Blot Immunoassay，CBI)快速检测蜡样芽抱杆菌的方法。

Nadine[38]等用酶联免疫技术选择出两种抗蜡样芽孢杆菌的单克隆抗体，这两种单抗均与蜡样芽孢杆菌活菌体反应，且不与起芽孢反应，并研究了联合这两种抗体来检测食品中蜡样芽孢杆菌的方法，此方法检测的最低限为102mL-1。

Chen[39]等运用免疫学方法，通过蜡样芽孢杆菌特定的表面抗原与特异的抗体相结合，实现了对蜡样芽孢杆菌快速检测。此方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点。

3 乳制品中蜡样芽孢杆菌的防控措施

蜡状芽孢杆菌污染牧场环境和生乳，既有致病性，也影响牛奶的质量，可造成牛奶的“甜酪”和“凝结乳脂”现象，导致淡炼乳出现凝块、苦味、酸味和腐败味[40]。

要防止蜡样芽孢杆菌污染乳制品，尤其是防止婴幼儿奶粉的污染，预防可能危害人体健康的潜在危险产生，就必须从原料乳开始，对生产的各个环节，可能产生污染的各种可能性进行分析，并制订相应的预防措施，建立监测方法，将原料乳生产中微生物指标提前控制，尤其要控制芽孢的数量，使其危害程度降到最低。建立并严格执行行之有效的HACCP(危害分析和关键控制点)系统，并把肠杆菌科作为生产线的卫生指标菌。要防止蜡样芽孢杆菌的污染，必须在乳制品加工过程中对各个环节进行严格消毒，同时通过适当巴氏杀菌、超高温杀菌或其他高温工艺可彻底的杀灭该菌。

近年来，研究者们对于蜡样芽孢杆菌的抑制作用做了很多研究。韩永霞，殷文正[41]等研究了温度、pH值、紫外线、固态介质对牛乳中蜡样芽孢杆菌生长的影响，研究表明，0℃以下和63℃以上不繁殖，65～70℃菌体易死去；耐酸碱范围广pH值为5～9，pH值大于10和pH值小于2时不生长；与氧气接触时生长更快，紫外线照射虽能抑制该菌的生长，但照射两小时后仍能较好生长。

王忠堂，姚咏明等[42]探讨了不同质量浓度核黄素对双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌生长的影响，发现核黄素对双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌生长具有促进作用,一定质量浓度核黄素还可提高菌悬液中双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌的长期存活率。

莫金观，邓金花等[43]比较了不同消毒剂对蜡样芽孢杆菌的杀灭效果，结果表明，过氧乙酸和二氧化氯对蜡样芽孢杆菌杀灭效果较好，常可用于对环境、生产场地、食品用具消毒。在乳制品中可以用于车间设备管道、室内空气以及工作人员手和衣物的清洗和消毒。

黄现青，史苗苗等[44]的研究结果表明，壳聚糖、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的最小抑菌质量浓度分别是10，2.5，0.039 g/L，以牛奶为介质，壳聚糖、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的质量浓度分别为5，0.02，0.01 g/L这一组合条件下对蜡样芽孢杆菌抑制作用最好，对蜡样芽孢杆菌杀菌率达83.5%。

乔支红，程永强等[45]通过研究乳酸对3种食源性致病菌的抑菌及杀菌作用，说明了乳酸对致病菌的抑菌、杀菌作用主要是通过延长致病菌的代时及破坏正常的细胞电位达到的。乳酸对蜡样芽孢杆菌最小抑菌质量浓度3.6 g/L、最小杀菌质量浓度7.2 g/L。

孟浩浩，李婷等[46]对牛乳UHT处理前后所含芽孢杆菌进行分离鉴定，结果表明超高温瞬时杀菌可以使蜡样芽孢杆菌完全失活，实现商业无菌，保证乳品质量。

4 结束语

蜡样芽孢杆菌作为一种条件致病菌，目前，研究者对它的污染来源、微生物特性、检测方法以及乳制品中的污染情况等方面已做了大量研究，这对于减少蜡样芽孢杆菌的危害具有重要的指导意义。但是目前乳制品生产过程中污染的蜡样芽孢杆菌是由于哪个生产工序引起还是未知的，而且许多检测方法和防控该菌的技术方法还处于理论研究阶段。相信随着研究的深入，防控蜡样芽孢杆菌污染乳制品的有效措施将被推出，从而真正做到防患于未然。国家婴幼儿配方食品食品安全标准(GB10765-2010)[47]中，对蜡样芽孢杆菌等条件致病菌没有明确的规定。鉴于蜡样芽孢杆菌的致病性以及其芽孢很强的抵抗能力和繁殖能力，建议婴幼儿配方奶粉的国家安全标准微生物限量指标中，增加蜡样芽孢杆菌等条件致病菌指标，确保婴幼儿乳品等食品的安全可控。

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