辅助发酵剂加速Provolone干酪成熟的研究

徐瑶，杨威，赵彦星，张东京，赵征

(天津科技大学，天津 300457)

0 引 言

Provolone(波萝伏洛)干酪是一种意大利半硬质干酪，消费前需经过成熟[1]。因而，干酪促熟具有很大的经济价值。近年来，干酪原料乳中微生物数量很低，低温巴氏杀菌使原料乳几乎达到了无菌状态[2]，一些利于产品风味品质的非发酵菌数量随之降低。为此，人们开始研究辅助发酵剂。辅助发酵剂(Adjunct Cultures)主要是非发酵剂乳酸菌(NSLAB)，是一类经筛选、特意添加到新鲜干酪中的微生物，可提高干酪的感官品质并加快其成熟[3-4]。瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)蛋白水解活力较强，能加速干酪成熟，并减少苦味肽的产生[5-6]。

本文将瑞士乳杆菌6024作为辅助发酵剂加速Provolone干酪的成熟，为辅助发酵剂加速干酪成熟提供一定的依据及可行性。

1 实 验

1.1 材料及设备

瑞士乳杆菌6024，脱脂乳粉(新西兰进口)，生鲜牛乳，发酵剂(DELVO-TEC MT-53A)；米黑根毛霉凝乳酶(FROMASE 750XLG)。

活性炭；百里香酚酞；氢氧化钠；中性甲醛；乙醇；乙醚；氢氧化钾；酚酞；壬烷；无水硫酸钠。

生化培养箱；拉伸机；离心机；质构仪；扫描电子显微镜；气相色谱-质谱联用仪。

1.2 菌株的活化

将保存的菌株进行3次以上的活化培养以恢复活力，按质量分数为2%接种量接种于质量分数为12%脱脂乳培养基，37℃条件下培养至凝乳，置于4℃冰箱备用。

1.3 Provolone干酪的制作

原料乳验收→巴氏杀菌 (63℃，30 min)→冷却→加发酵剂→发酵→加氯化钙→发酵终点时实验组加入1%瑞士乳杆菌→加凝乳酶→凝块切割→加热搅拌→排乳清→堆酿→加盐→拉伸(中心温度55℃)→肠衣包装→成熟(10℃，90 d)

1.4 Provolone干酪成熟期间游离氨基酸的测定

游离氨基酸(FAA)是干酪中蛋白质水解的主要产物，测定干酪中FAA质量分数能进一步说明成熟过程中蛋白质的水解情况，是干酪成熟过程中的一个主要指标。同时这些降解产物对于干酪风味的形成非常重要。

干酪中的游离氨基酸的测定采用甲醛法进行测定。具体操作如下：

称取样品5.00～10.00 g于烧杯中，加入50 mL蒸馏水、约5 g活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40 mL热水洗涤活性炭，收集滤液，加3～5滴百里香酚酞，用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。加入20 mL中性甲醛，摇匀，静置1 min，此时蓝色已消失，再用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。记录第二次滴定时所消耗的碱液毫升数。

计算公式如下：

氨基酸态氮(μg/g)=N×V×0.014/W×106，

式中：N为氢氧化钠标准溶液的浓度；V为氢氧化钠标准溶液的消耗量(第二次)；W为样品溶液相当于样品的量；0.014为氮的毫克当量。

1.5 Provolone干酪成熟期间游离脂肪酸的测定[7]

(1)称取1.00 g样品，加入25 mL乙醇乙醚溶液，将干酪充分磨碎，移入离心管中，再用25 mL的溶液充分冲洗，将所有溶液移入离心管内，离心(4 000 r/min，20 min)，将上清液移入三角瓶中，加入3滴酚酞指示剂，用标定的浓度为0.1 mol/L氢氧化钾乙醇溶液滴至粉红色，15 s不褪色，记录体积。

(2)计算

游离脂肪酸质量分数 (以油酸计)=[(V×N×282)/(W×1000)]×100%，

式中：V为所用氢氧化钾标准溶液的体积；N为所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度；282为油酸的相对分子质量；W为样品的质量。

1.6 干酪成熟期间质构特性

干酪样品用打孔器处理成圆柱形，直径20 mm，厚度10 mm，取样后至测试前均统一放置于0～4℃冰箱中，防止温度对产品质地产生影响。

采用质构仪，以TPA二次下压法测定干酪的硬度和弹性。具体参数：测试前探头下降的速度为5.0 mm/s：测试中探头下降的速度为1.0 mm/s；测试后探头回程速度为1.0 mm/s；压缩比为45%；两次压缩间隔时间为5 s；触发力为5.0 g；探头直径和类型为P/36R。

1.7 干酪微观结构的测定

将样品切成8 mm×2 mm×1 mm的小块，每个样2～3个平行，用2.5%的戊二醛进行固定，放置在4℃冰箱中进行过夜。然后用pH7.3的磷酸缓冲液冲洗三次，每次10 min。再分别用体积分数为30%，50%，70%，90%，100%的乙醇进行脱水，每次10 min,用氯仿脱脂2 h，间隔摇晃。最后冷冻干燥，粘台，镀金，观察。

1.8 干酪风味物质的测定

应用GC-MS测定Provolone干酪成熟60 d、90 d时挥发性风味物质成分，以匹配度确定化合物名称，以壬烷为内标物进行半定量分析[8-9]。

(1)样品处理方法

取1.500 g奶酪样品，加等量的无水Na2SO4混合均匀，迅速将样品装入15 mL的样品瓶内，并加入40 μg壬烷作为内标，加盖封口。在60℃水浴中平衡30 min，顶端插入PDMS/DVB萃取头，于60℃水浴萃取30 min后，用GC-MS分析。

(2)色谱和质谱条件

①色谱条件

分离柱为VF-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度为250℃；载气为He；载气流速为1.0 mL/min；程序升温为40℃，3 min；以5℃/min至140℃；以10℃/min升至240℃，保持8 min。

②质谱条件

离子源温度为220℃；传输线温度为280℃；离子化模式为EI；电子能为70 eV；扫描范围为43～500(amu)；数据采集：全扫描。

1.9 数据分析

采用SPSS16.0对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 Provolone干酪成熟期间游离氨基酸的测定

干酪成熟期间游离氨基酸质量分数变化如图1所示。

图1 干酪成熟期间游离氨基酸质量分数变化

随着成熟时间的延长，干酪中的酪蛋白不断降解为多肽，多肽降解为游离氨基酸，这些降解过程同时发生。酪蛋白降解为多肽是通过凝乳酶和细菌内蛋白酶完成，只有细菌酶才能进一步降解多肽生成游离氨基酸，而凝乳酶不能降解个体氨基酸分子。由图1可以看出，两组干酪中的游离氨基酸质量分数均呈上升趋势，成熟60 d时，实验组游离氨基酸质量分数达到了对照组90 d时的质量分数，90 d时两组干酪游离氨基酸质量分数差异显著 (P＜0.05)，说明瑞士乳杆菌6024作为辅助发酵剂能显著增加干酪中游离氨基酸质量分数，加速蛋白质降解。

2.2 干酪成熟期间游离脂肪酸质量分数测定

干酪成熟期间游离脂肪酸质量分数变化如图2所示。

在干酪成熟期间，脂肪水解是重要的生化反应之一，脂肪在微生物和酶等的作用下发生缓慢水解，产生游离脂肪酸(FFA)。由图2可以看出，随着成熟时间的延长，干酪中的脂肪不断降解，两组干酪中游离脂肪酸质量分数均呈上升趋势但差异不显著性 (P＞0.05)，说明瑞士乳杆菌6024作为辅助发酵剂对干酪脂肪降解无显著性影响。

图2 干酪成熟期间游离脂肪酸质量分数变化

2.3 干酪成熟期间质构特性分析

干酪成熟期间硬度和弹性变化分别如图3和图4所示。

图3 干酪成熟期间硬度变化

图4 干酪成熟期间弹性变化

干酪成熟期间蛋白质、脂肪发生水解，肽键断裂，酪蛋白的网状结构遭到破坏，硬度、弹性随之下降，干酪质地表现出了成熟特征。由图3和图4可以看出，随着成熟时间的延长，两组干酪的硬度、弹性均呈下降趋势。实验组干酪60 d时硬度(7001.260)、弹性(0.823)与实验组90 d时(6996.866，0.825)相比差异不显著(P＞0.05)。

2.4 干酪成熟期间微观结构的测定

干酪成熟期间微观结构变化如图5所示。

由图5可以看出，干酪体系中均匀分布一个网状结构，类似于海绵结构，其中酪蛋白结合聚集，没有明确方向，随着成熟时间的不断延长，两种干酪的微观结构发生了明显改变，实验组干酪60 d时微观结构与对照组90 d时微观结构相似，形成了更大的分子空穴，蛋白胶束变得更加纤细。

图5 干酪成熟期间微观结构变化

2.4 干酪成熟期间风味物质测定

两组干酪成熟60 d和90 d时风味物质测定结果分别如表1和表2所示。

表1 干酪成熟60 d时挥发性化合物种类及其质量分数

表2 干酪成熟90 d时挥发性化合物种类及其质量分数

由表1和表2可以看出，成熟60 d时，实验组干酪共分离鉴定出10种挥发性风味化合物，分别为醛类1种，酮类2种，烃类3种，醇类4种，其中烃类物质质量分数最多，挥发性风味化合物总质量分数为99.991 μg·g-1；对照组干酪共分离鉴定出12种挥发性风味化合物，分别为醛类2种，酮类2种，烃类3种，醇类5种，其中酮类物质质量分数最多，挥发性风味化合物总质量分数为99.990 μg·g-1。

成熟90 d时，实验组干酪共分离鉴定出13种挥发性风味化合物，分别为醛类1种，酮类3种，烃类3种，醇类2种，酯类1种，呋喃类1种，酚类2种，其中酮类物质质量分数最多，挥发性风味化合物总质量分数为99.996 μg·g-1；对照组干酪共分离鉴定出13种挥发性风味化合物，分别为醛类1种，酮类3种，烃类4种，醇类2种，酯类1种，酚类2种，其中醇类物质质量分数最多，挥发性风味化合物总质量分数为99.996 μg·g-1。

随着成熟时间的延长，干酪的风味物质种类不断增加。与成熟90 d对照组干酪相比，实验组干酪成熟60 d时风味物质种类少两种，但总量没有显著差异。

3 结 论

瑞士乳杆菌6024作为辅助发酵剂添加到Provolone干酪中，对干酪中游离脂肪酸质量分数没有显著影响，但能显著增加干酪游离氨基酸质量分数，加速蛋白质降解，60 d时达到对照组90 d时的质量分数，此时干酪的质构特性、微观结构、风味物质均与对照组90 d时差异不显著。由此可知，瑞士乳杆菌6024作为辅助发酵剂可加速Provolone干酪的成熟，缩短成熟时间。

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