HPLC法测定阿胶中6种氨基酸的含量

王翠芬 吕彩莲 彭思梅 黄玉兰 陈建萍

·论著·

HPLC法测定阿胶中6种氨基酸的含量

王翠芬 吕彩莲 彭思梅 黄玉兰 陈建萍

目的通过柱前衍生化, 高效液相色谱(HPLC)法测定阿胶中6种氨基酸的含量。方法色谱柱为Hypersil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相A：乙腈-0.1mol/L乙酸钠(7：93), 用乙酸调节pH为6.5, 流动相B：乙腈-水(4：1), 梯度洗脱；柱温为42℃；流速为1.0 ml/min；检测波长254 nm；异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化。结果30 min内6种氨基酸分离完全, 峰面积与浓度的线性关系良好, r=0.999。加样回收率97.33%～100.17%, RSD＜3。结论HPLC法测定阿胶中6种氨基酸的含量方法操作流程简单、快速、准确, 可用于该制剂的质量控制和检验。

HPLC；阿胶；氨基酸；含量

阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶［1］。具有补血止血, 滋阴润肺的功能。临床多用于血虚萎黄、眩晕心悸、肺燥咳嗽、吐血尿血、便血崩漏、妊娠胎漏等［2］。阿胶主要是由蛋白质(约含80%)、氨基酸以及多种微量元素组成, 其药理作用与其所含氨基酸和微量元素有关。阿胶中至少含有17种水解蛋白氨基酸, 以甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸为主要氨基酸, 均占总氨基酸含量的7%以上［3］。阿胶中含有8种人体必需氨基酸,占总氨基酸含量的15.98%～20.22%, 以赖氨酸和精氨酸的含量最高, 约占4%～5.20%和7.15%～10.06%。本文通过HPLC法, 柱前衍生化测定阿胶中主要的6种氨基酸：L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量。

1 材料

1. 1仪器 STI2000高效液相色谱仪(Model500高压输液泵, UV501可变波长检测器, VI2010色谱工作站)。电子天平(1/10万, 赛多利斯科学仪器北京有限公司)。KQ-250E超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。真空泵(广东海利集团)。SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。SZ-97A自动三重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。AE240分析天平(METTLER)

1. 2试剂 L-羟脯氨酸对照品(111578-200201)、甘氨酸对照品(140689-201103)、丙氨酸对照品(110873-201203)、L-脯氨酸对照品(140677-200405)、谷氨酸对照品(140690-201203)和精氨酸对照品(140685-200802)均为中国药品生物制品检定所提供；乙腈、乙酸钠、正己烷为色谱纯；异硫氰酸苯酯及其他试剂均为分析纯。阿胶由山东福胶集团东阿镇阿胶有限公司提供。

2 方法

2. 1色谱条件 STI2000高效液相色谱仪, Vertex C18色谱柱为Hypersil C18(4.6×250 mm ＞ 5 μm), UV501紫外检测器。流动相A：乙腈-0.1 mol/L乙酸钠(7：93), 用乙酸调节pH为6.5, 流动相B：乙腈-水(4：1), 按表1进行梯度洗脱。柱温为42℃；流速为1.0 ml/min；5 μl定量管进样, 检测波长为254 nm。理论塔板数按照L-羟脯氨酸计＞4000。

表1 梯度洗脱程序

2. 2溶液的制备

2. 2. 1混合对照品溶液的配制 取L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸对照品适量, 精密称定,加0.1 mol/L盐酸溶液制成每1 ml分别含L-羟脯氨酸0.36 mg、甘氨酸0.92 mg、丙氨酸0.33 mg、L-脯氨酸0.51 mg、谷氨酸0.43 mg和精氨酸0.44 mg的混合对照品溶液。

2. 2. 2样品溶液的配制 取阿胶粗粉约0.25 g, 精密称定,置25 ml量瓶中, 加0.1 mol/L盐酸溶液20 ml, 超声处理30 min(功率500 W, 频率40 Hz), 放冷, 加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度, 摇匀。精密量取2 ml置5 ml安瓶中, 加浓盐酸2 ml,拉丝封口, 150℃水解1 h, 放冷, 移至蒸发皿中, 用水10 ml分次洗涤, 洗液并入蒸发皿中, 蒸干, 残渣加0.1 mol/L盐酸溶解, 移至25 ml量瓶中, 加0.1 mol/L盐酸至刻度, 摇匀即得。

2. 2. 3异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化物的制备 取上述6种氨基酸混合对照品溶液和样品溶液各2 ml, 分别置10 ml离心管中, 各加0.1 mol/L PITC的乙腈溶液1.0 ml, 1 mol/L三乙胺的乙腈溶液1.0 ml, 漩涡混合1 min, 放置1 h后, 加正己烷4 ml, 漩涡混合1 min, 放置10 min, 取下层溶液再次加正己烷4 ml萃取, 放置10 min, 取下层溶液, 滤过, 取续滤液, 即得。

3 结果

3. 1可行性考察 按“2.1”项下色谱条件进行测定, L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸分离度良好, 见图1。

图1 对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图

3. 2线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、2、3、4、5、 6 ml, 分别置于10 ml量瓶中, 用0.1 mol/L盐酸加至刻度, 摇匀, 按2.2.3项下衍生化处理后, 分别吸取5 μl进样。以色谱峰面积为纵坐标, 对照品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程。见表1。

3. 3精密度试验 取同一批阿胶按“2.2.2”法配制样品溶液,按“2.2.3”项下衍生化处理后, 吸取5 μl进样, 重复进样5次,测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的峰面积。结果RSD分别为1.57%、0.93%、1.92%、1.86%、1.39%、1.87%。试验结果表明精密度良好。

3. 4重现性试验 取同一批阿胶按“2.2.2”法配制样品溶液5份, 按“2.2.3”项下衍生化处理后, 吸取5 μl, 重复进样3次, 测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的峰面积。结果RSD分别为1.25%、0.99%、1.37%、1.86%、1.65%、1.86%。试验结果表明重现性良好。

3. 5稳定性试验 取阿胶样品溶液, 衍生化后分别于0、2、4、10、24 h进样, 每次5 μl, 分别测定峰面积。结果24 h内测得的结果基本一致。

3. 6回收率实验 取阿胶粗粉10 mg, 共5份, 按“2.2.1”法配制, 精密加入氨基酸对照品混合溶液10 ml, 按2.2.3项下方法衍生化后得样品溶液, 测定各氨基酸的含量, 计算回收率。结果L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的平均回收率分别为99.28%、100.17%、98.65%、97.84%、98.47%、97.33% RSD均＜3%。

3. 7样品含量测定 取6个不同批次的阿胶, 每批3份, 按“2.2.2”法配制, 按“2.2.3”项下衍生化处理得样品溶液, 按“2.1”色谱条件进行测定, 结果见表2, RSD为0.8%～2.8%。

表1 6种氨基酸的回归方程

表2 6批阿胶样品6种氨基酸含量测定(%, n=3)

4 讨论

4. 1氨基酸分析方法有柱前衍生化和柱后衍生化［4］, 因为柱后衍生化需要专门的柱后衍生器, 分析时间也较长。本文采用柱前衍生化测定阿胶中氨基酸含量。因异硫氰酸苯酯(PITC)与氨基酸和亚氨基酸均能反应, 不生成对氨基酸测定有干扰的副产物, 并且生成产物稳定, 所以采用PITC衍生化。

4. 2程显隆等［5］测定阿胶中4种氨基酸含量时柱温为43℃；谢谊等［6］测定阿胶中17种氨基酸含量采用柱温为30℃, 本文考察了柱温为30、31、32、40、41、42、43℃时各氨基酸的分离情况, 结果发现42℃时分离的效果最佳。

近年来, 随着阿胶价格的上涨, 市场上常有伪品混充,并且制假手段层出不穷, 越来越高明。2010年版《中国药典》改进了阿胶的含量测定, 要求4种氨基酸的含量为：L-羟脯氨酸≥8.0%, 甘氨酸≥18.0%, 丙氨酸≥7.0%, L-脯氨酸≥10.0%［1］。本文用反相高效液相柱前衍生化测定阿胶中6种主要氨基酸的含量, 不仅符合药典中4种氨基酸含量的要求, 还测定了另外2种主要氨基酸：谷氨酸、精氨酸的含量,较之药典更为全面, 并且本方法操作流程简单、快速、准确,可用于阿胶的质量控制。

［1］ 国家药典委员会.中国药典.一部, 2010.

［2］ 刘学萍. 阿胶及其伪品的鉴别.中国医药指南, 2010, 8(30): 228-229.

［3］ 霍光华.阿胶氨基酸矿物成分分析与评价.氨基酸和生物资源, 1996, 18(4):22-24.

［4］ 于泓, 牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展.分析化学, 2005, 33(3):398.

［5］ 程显隆, 肖新月, 邹秦文, 等.柱前衍生化HPLC法同时测定阿胶中4种主要氨基酸的含量.药物分析杂志, 2008, 28(12): 1997-2000.

［6］ 谢谊, 易艳, 刘阳, 等.柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量.湖南中医药大学学报, 2012, 5(32):46-49.

Determination of 6 kinds of amino acid content in Ejiao by HPLC method

WANG Cui-fen, LYU Cai-lian, PENG Si-mei, et al. Maoming Petrochemical Hospital, Maoming 525011, China

ObjectiveTo determine content of 6 kinds of amino acids in Ejiao by HPLC method.MethodsThe column was Hypersil C18 (4.6 mm x 250 mm, 5μm); the A of the mobile phase: Acetonitrile -0.1mol/L sodium acetate (7:93), the PH adjusted to 6.5 with acetic acid, the B of the mobile phase: Acetonitrile water (4:1), Gradient elution; the column temperature was 42℃; the flow rate was 1 ml/min; the detection wavelength was 254 nm; Phenyl was othiocyanate (PITC) pre column derivatization.Results6 kinds of amino acids separation completely within 30 minutes; good linear relationship of peak area and concentration, R=0.999, the recovery rate of 97.33%～100.17%, RSD＜3.ConclusionThe HPLC method to determine the content of 6 kinds of amino acids of donkey hide gelatin method of operation is simple, fast, accurate and can be used for quality control and inspection of the preparation.

HPLC; Ejiao; Amino acid; Content

525011 广东省茂名石化医院药剂科