SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性
2014-07-05麻文青连福治汪金泉
麻文青 连福治 汪金泉 杨 磊,△
SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性
麻文青1连福治2汪金泉3杨 磊1,2△
目的 采用实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQTRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果。结果RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为98.92%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性(r2=0.762 5)。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。
端粒;基因扩增;酶联免疫吸附测定;端粒酶活性;端粒重复序列扩增;TRAP-ELISA
端粒酶是一种核糖核蛋白复合体[1]。在绝大多数永生化细胞系和肿瘤细胞中端粒酶活性较高[2]。因此,端粒酶可能为肿瘤的诊断和治疗提供新的方向[3]。目前端粒酶活性的检测主要采用TRAP-ELISA 法[4]。但是该法存在检测时间长、成本相对较高等缺点。近年来,有研究将定量PCR与TRAP法结合起来,采用荧光染料SYBR Green,建立了SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)[5]。本实验采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA法检测不同细胞端粒酶活性,旨在证实RQ-TRAP法的优势。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂 细胞由本室保存及其他实验室惠赠,RPMI-1640培养基、DMEM培养基和新生胎牛血清均为Hy-Clone产品,TRAP-ELISA端粒酶检测试剂盒TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS购于Roche公司;RQ-TRAP引物参照文献序列如下:TS 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′,ACX 5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′,由上海桑尼生物科技有限公司合成。SYBR Green实时定量试剂盒购于TaKaRa公司,所用定量PCR仪为Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。
1.2 细胞培养 所选细胞包括人肾上皮细胞系293T细胞、人肝癌细胞系HepG2细胞、人乳腺癌细胞系MCF7细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞、人肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC-12细胞、人结肠腺癌细胞系RKO细胞、人急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞、人淋巴瘤细胞系U937细胞和人卡巴式肉瘤相关疱症病毒感染细胞系BCBL-1细胞,以及人肝细胞系L-02细胞、人视网膜色素上皮细胞系D407细胞和鼠成纤维细胞系L929细胞。Jurkat细胞、U937细胞、BCBL-1细胞培养在含10%新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素溶液的RPMI-1640培养基中,其他细胞均常规培养在含10%新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液中,所有细胞均在37℃、5%CO2和95%相对湿度条件下孵育培养。每2~3 d传代1次。
1.3 细胞蛋白提取液的制备 RQ-TRAP用细胞蛋白提取液按Kim法制备:收集细胞,PBS冲洗1次,10 000×g4℃离心1 min收集细胞,沉淀细胞用预冷的洗液[10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸氢氧化钾(Hepes-KOH,pH 7.5),1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl,1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)]重悬,再离心,重悬1×104~1×106个细胞在20 μL预冷的细胞裂解液里[10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl(pH 7.5),1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA),0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),5 mmol/L β-巯基乙醇,0.5%3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS),10%甘油]。冰上孵育30 min,16 000×g4℃离心20 min,收集上清,迅速冷冻,-80℃保存。TRAP-ELISA用细胞蛋白提取液制备方法按照TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS(Roche Molecular Biochemicals)试剂盒说明制备。取5 μL的细胞提取液加入2 μL DNase-free RNase(0.5 g/L),37℃孵育20 min以灭活端粒酶,作为实验阴性对照。
1.4 RQ-TRAP检测端粒酶活性 依照参考文献[5]检测RQTRAP端粒酶活性,定量PCR采用Takara SYBR PremixEx TaqTM实时定量试剂盒(Takara DRR041A)。取5倍系列稀释的端粒酶阳性的293T细胞提取液(1 000、200、40、8个细胞),以及2种阴性对照样本分别作为PCR模板同时进行定量PCR反应。2种阴性对照按照如下方法设立。(1)以裂解液替代细胞提取液,用以监测PCR过程是否有污染。(2)RNase处理后,端粒酶RNA模板被降解,作为检测样本的自身对照。定量PCR反应体系(20µL)为:SYBR Premix Ex Taq(2×)10 µL,PCR Forward Prime TS(10µmol/L)0.8µL,PCR Reverse Prime ACX(10µmol/L)0.4µL,ROX Reference Dye(50×)0.4 µL,模板(细胞提取液)1µL。PCR反应程序包括:(1)端粒延长,25℃孵育20 min。(2)端粒酶灭活,95℃5 min。(3)扩增循环,95℃变性5 s,60℃退火/延伸31 s,共40个循环。运用ABI7300软件采集和分析数据,通过软件可以计算出标准品和所有样品达到荧光阈值的循环数(Ct),以细胞数为横坐标轴,Ct值为纵坐标轴做标准曲线。取1 000个细胞制备的细胞提取液进行样品检测,评价方法为每个样品相对于同样细胞数293T细胞的端粒酶活性的比值。每个样本重复3次。
1.5 TRAP-ELISA法检测端粒酶活性 参照Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS试剂盒及文献操作说明进行操作。收集培养的活力良好的细胞并计数2×105个细胞,冷PBS洗2次,加裂解液200µL,冰上裂解30 min, 16 000×g低温离心20 min,取上清3µL加入TRAP反应液并加无核酸酶的水补足50µL进行PCR扩增,平行对照组于检测前经RNase处理。反应条件为:引物延长25℃30 min;端粒酶灭活94℃5 min;扩增条件:变性94℃30 s;退火50℃30 s;延伸72℃90 s循环30次。取2.5µL扩增产物,每个样品加10µL变性液,室温反应10 min,加杂交液100µL,充分混匀,将上述混合液体加入到链霉亲和素包被的微量反应板中,300 r/min 37℃孵育2 h;弃去杂交液,轻轻地用冲洗缓冲液清洗3次,向每孔中加入100µL抗地高辛过氧化物酶,300 r/min摇床室温30 min;弃去液体,用冲洗缓冲液清洗5次,加100µL TMB底物液,室温下观察颜色反应。端粒酶阳性时,液体由无色透明逐渐变蓝,加入终止液,颜色由蓝变黄。加入终止液后30 min,在酶标仪上测450 nm处吸光度值,参考波长为690 nm。每个样本重复3次。
1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示;RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法的关联性用线性回归模型分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RQ-TRAP标准曲线 4个浓度的293T细胞提取液均检测到扩增产物,而2种阴性对照均没有检测到扩增产物。随着模板浓度的降低,Ct值随着增大,但在8个细胞的裂解液中也能有效地检测出扩增产物,见图1A。PCR产物的熔解曲线显示为单峰,没有引物二聚体的形成,见图1B。PCR结果做标准曲线显示扩增斜率为-3.34,决定系数(R2)达到0.997,扩增效率为98.92%。
Fig.1 The standard curve of telomerase activity measured by RQ-TRAP图1 RQ-TRAP测定端粒酶活性标准曲线
2.2 RQ-TRAP与TRAP-ELISA检测端粒酶活性结果比较 两种方法测得12种细胞的相对端粒酶活性,见表1。两种方法测得的端粒酶活性存在相关性(r2=0.762 5,P<0.05)。端粒酶活性结果还显示,两种方法测得的肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。
Tab.1 Comparison of telomerase activity measured by RQ-TRAP and TRAP-ELISA表1 RQ-TRAP和TRAP-ELISA测得相对端粒酶活性比较
3 讨论
本实验是采用端粒重复序列扩增和SYBR Green荧光定量PCR相结合的SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增(RQ-TRAP)方法检测端粒酶活性,以缩短操作时间、减少繁琐的扩增后操作步骤(如聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA等)。实验采用Kim等[6]文献报道的TS和ACX引物,无引物二聚体的形成。同时RQ-TRAP方法能准确特异地检测12种细胞的端粒酶活性,且在8个细胞浓度时仍能有效地检测,显示该方法具有较高灵敏度。同时,扩增效率达98.92%,可高效率地检测端粒酶活性。
目前,TRAP-ELISA检测端粒酶活性方法较为常用,它具有灵敏、特异及可定量人端粒酶活性等优点,但是仍存在扩增后处理时间较长,成本相对较高等问题。近年来,有研究将定量PCR与TRAP法结合起来,采用荧光染料SYBR Green建立了一种新的端粒酶活性检测方法,即RQ-TRAP法。Wege等[5]研究认为TRAP-ELISA与RQ-TRAP有相关性,且RQ-TRAP有耗时短、线性结果可靠等优点。另外Hou等[7]的研究也表明RQ-TRAP方法是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。本实验将研究样本增加到12个细胞系,包括肿瘤细胞系和正常细胞系。利用RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法同时检测端粒酶活性,并对两种方法进行相关性分析,实验结果显示:9个肿瘤细胞系的相对端粒酶活性均高于3个正常细胞系,这一结果与普遍认为的肿瘤细胞有较高的端粒酶活性相一致。用RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA结果相关性为r2=0.762 5,表明RQ-TRAP方法可以作为一种检测端粒酶活性的方法,与TRAP-ELISA方法比较,它消除了扩增后复杂的ELISA过程,缩减了时间和繁琐的操作步骤,降低了成本,可以高通量进行,提高了检测效率,是一种可靠、能快速定量端粒酶活性的方法。
端粒酶在肿瘤组织中的检出率为85%~95%,而在非肿瘤组织和各种正常组织中其检出率为4%~6%[8]。本研究中3种正常细胞系的端粒酶活性均低于其他9个肿瘤细胞系,此结果符合目前研究成果,所以RQ-TRAP法是一种可靠地检测端粒酶活性的方法。
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(2014-02-21收稿 2014-03-31修回)
(本文编辑 魏杰)
Combined SYBR Green Real-Time with Telomeric Repeat Amplification Protocol(RQ-TRAP) to Detect Telomerase Activity
MA Wenqing1,LIAN Fuzhi2,WANG Jinquan3,YANG Lei1,2
1 Medical College,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2 Medical College,Hangzhou University;3 College of Life and Environmental Sciences,Shihezi University YANG Lei,E-mail:yanglei62@hznu.edu.cn
ObjectiveTo establish methodology to detect telomerase activity based on real-time quantitative PCR technique combined with telomeric repeat amplification protocol(TRAP).MethodsRQ-TRAP system was developed by combining real-time quantitative PCR technique with conventional TRAP method.Telomerase activity was assessed and compared by RQ-TRAP assay and TRAP connected with enzyme-linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA)respectively in 12 kinds of cells.ResultsThe RQ-TRAP method was both accurate and specified in measuring telomerase activity in a series dilution of protein extracts from 293T cells.The sensitivity of this method was 8 cells and the amplification efficiency was 98.92%.Telomerase activity was not detected in negative control group.Statistical analysis revealed a strong correlation between the two assays(r2=0.762 5).ConclusionThe feasibility of RQ-TRAP was proved in this article.Compared with TRAP-ELISA,RQ-TRAP has many advantages.Apart from sample extraction and real-time PCR cycling,no other extra time-consuming steps are needed for telomerase quantification;RQ-TRAP is less costly and more rapid and reliable than TRAP-ELISA for quantification of telomerase activity and it also support high throughput.
telomere;gene amplification;enzyme-linked immunosorbent assay;telomerase activity;telomeric repeat amplification protocol;TRAP-ELISA
R34
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.003
国家重大科学研究计划项目(2012CB911200)
1石河子大学医学院(邮编832000);2杭州师范大学医学院;3石河子大学生命科学学院
△通讯作者 E-mail:yanglei62@hznu.edu.cn