下调microRNA-1对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用

郑君毅 蔡 英 丛洪良Δ 周 津

细胞与分子生物学

下调microRNA-1对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用

郑君毅1蔡 英2丛洪良1Δ周 津1

目的 研究下调microRNA（miRNA，miR）-1在H2O2诱导的心肌细胞损伤中的保护作用及其机制。方法将大鼠H9c2心肌细胞株分为4组，Blank组、NC组、H2O2组和H2O2+AS-miR-1组。Blank组不做任何处理，NC组细胞转染随机合成的miRNA阴性对照片段；H2O2组和H2O2+AS-miR-1组分别为不转染和转染miR-1 inhibitor（AS-miR-1）的H2O2细胞损伤组。采用定量PCR方法检测各组miR-1表达水平，MTT和流式细胞术检测细胞生存率和凋亡情况，利用生物信息学预测miR-1的靶基因，荧光定量PCR和Western Blot的方法检测靶基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达情况。结果Blank组和NC组相比较，各个指标差异均无统计学意义。H2O2组细胞的miR-1 mRNA表达水平显著升高，生存率降低，凋亡增加，Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均明显降低。转染AS-miR-1，可以降低H2O2诱导的心肌细胞损伤，提高细胞生存率，降低细胞凋亡率，上调Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。结论下调miR-1表达可以通过升高凋亡抑制因子Bcl-2的表达水平降低H2O2诱导的心肌细胞凋亡，发挥心肌细胞保护作用。

微RNAs；肌细胞，心脏；细胞凋亡；转染；氧化性应激；过氧化氢；miR-1

氧化应激是机体氧化和抗氧化不平衡的一种状态，是引起心肌细胞损伤、心血管系统结构功能异常的重要原因之一，与多种心血管系统疾病密切相关[1]。MicroRNA（miRNA，miR）是一类具有负性调节作用的内源性小RNA，参与组成RNA诱导沉默复合体（RISC），通过剪切或抑制mRNA的翻译抑制基因的表达。miRNA可调节细胞分化、增殖、凋亡等，参与肿瘤、心脏疾病、神经系统疾病的生理和病理过程。miR-1是近几年发现的与心血管系统疾病关系最为密切的miRNA，在急性心肌梗死[2-3]、缺血再灌注[4]、心律失常[5]等疾病中都检测到高表达的miR-1。本研究旨在建立H2O2诱导的心肌细胞氧化应激模型，观察下调miR-1对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 大鼠心肌细胞株H9c2购自中科院上海细胞库。RNA提取试剂Trizol、DEPC水、逆转录试剂、Platinum SYBR Green qPCR试剂盒、转染试剂脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。DMEM培养基、胎牛血清和0.05％胰酶/EDTA购自美国Gibco公司。miR-1 inhibitor（AS-miR-1）和阴性对照片段购自上海吉玛公司。Bcl-2和β-actin抗体购自天津联星生物公司。ECL化学发光试剂盒为millipore公司产品。FITC Annexin V凋亡试剂盒和流式细胞仪为BD公司产品，电泳系统和定量PCR仪为伯乐公司产品。

1.2 大鼠心肌细胞的培养 H9c2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO2培养箱内培养，每隔2～3 d细胞传代1次。在实验前24 h将生长状态良好的细胞换液备用。

1.3 细胞分组和转染 实验分为4组。（1）Blank组：不做任何处理的正常H9c2细胞。（2）NC组：细胞转染随机合成的miRNA片段作为阴性对照。（3）H2O2组：细胞培养液中加入H2O2，使其终浓度为0.1 mmol/L，建立氧化应激细胞模型。（4）H2O2+AS-miR-1组：细胞转染miR-1 inhibitor（AS-miR-1）片段，然后加入终浓度为0.1 mmol/L的H2O2。根据miRNA产品使用说明，在转染前，将miR-1 inhibitor和转染试剂脂质体Lipofectamine 2000用不含血清的培养基Opti-MEM分别稀释，室温孵育5 min，然后将两者轻轻混匀，室温下孵育20 min。将miR-1 inhibitor-lipo 2000混合液加入细胞培养液中，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。24 h后收集各组细胞进行检测。

1.4 RT-PCR检测miR-1表达 将处理24 h后的各组细胞分别用Trizol提取细胞总RNA并进行逆转录。用SYBR Green qPCR试剂盒分别进行miR-1和U6的荧光定量PCR扩增，其中U6为内参，对各组的miR-1表达进行校准。PCR反应体系为20µL，包括2µL的cDNA，上下游引物各1µL，SYBR Green qPCR试剂10µL，其余为ddH2O。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，进行40个循环。miR-1相对表达量的计算：△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，以公式2-△Ct计算所得值表示miR-1相对表达量。实验重复3次。

1.5 MTT实验 将处于对数生长期的细胞以合适的细胞密度接种于96孔板中，培养24 h后根据上述分组情况对各组细胞进行不同的处理，每组设6个复孔，另设6个调零孔即只加细胞培养液的孔。继续培养24 h后进行MTT实验。设Blank组的细胞生存率为100％，实验组细胞生存率（％）=实验组吸光度（A）值/Blank组A值×100％。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组处于对数生长期的细胞按照1×105/孔接种于6孔板中，将转染后24 h的各组细胞分别消化、离心、收集，PBS洗涤2次，离心去上清。向收集到的细胞沉淀中加入200µL binding buffer并吹打成单细胞悬液，加入5µL AnnexinV-FITC和5µL PI试剂，轻轻混匀后室温避光放置15 min，进行流式细胞仪检测。

1.7 靶基因Bcl-2 mRNA表达水平的检测 Trizol一步法提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，-20℃保存。用SYBR Green qPCR试剂盒分别进行目的基因Bcl-2和内参基因β-actin的荧光定量PCR扩增。PCR条件为：95℃预变性5 min；94℃变性15 s，60℃退火45 s，扩增40个循环；72℃延伸5 min。计算目的基因Bcl-2的相对表达量。

1.8 Bcl-2蛋白表达水平的检测 将转染后24 h的各组细胞分别提取总蛋白，BCA法测蛋白定量。取40µg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电流大小分别为20 mA（浓缩胶）和40 mA（分离胶），电泳至指示剂到达凝胶底部时，停止电泳。根据蛋白Marker的分子质量大小，切取包含Bcl-2或β-actin条带的凝胶，进行转膜，转膜条件为：冰浴下80 V，60 min。将NC膜放入5％脱脂奶粉中室温封闭2 h，加入一抗（Bcl-2，1∶500稀释；β-actin，1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2 h。根据ECL化学发光试剂盒说明进行显影，化学发光成像系统扫描吸光度值后用软件分析Bcl-2蛋白表达水平。

1.9 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件处理数据，计量资料均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定量PCR检测miR-1结果 实时荧光定量PCR结果显示，Blank组和NC组miR-1表达量较低，两者比较差异无统计学意义。H2O2组细胞miR-1基因的表达水平明显高于Blank组和NC组（P＜0.05），H2O2诱导细胞损伤的同时转染miR-1 inhibitor能明显降低H2O2引起的miR-1基因表达水平的上升（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison index between groups表1 各组细胞检测指标结果比较 （±s）

Tab.1 Comparison index between groups表1 各组细胞检测指标结果比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与Blank组比较，b与NC组比较，c与H2O2组比较，P＜0.05

组别Blank组NC组H2O2组H2O2+AS-miR-1组F n3333 miR-1的相对表达量0.66±0.14 0.71±0.16 2.34±0.74ab1.05±0.29c11.172＊＊细胞生存率（％）100.00±8.61 97.87±10.21 52.82±9.98ab79.09±12.56abc26.347＊＊组别Blank组NC组H2O2组H2O2+AS-miR-1组F n 3333细胞凋亡率（％）3.13±0.45 3.33±0.70 12.03±1.15ab8.43±1.94abc38.386＊＊Bcl-2 mRNA 2.38±0.13 2.39±0.15 1.82±0.11ab2.06±0.20ab9.721＊＊蛋白0.95±0.05 0.94±0.11 0.68±0.12ab0.87±0.09c5.314＊＊

2.2 MTT法检测各组细胞生存率 与Blank组相比，NC组细胞的生存率无明显变化，H2O2组明显下降（P＜0.05）。转染miR-1 inhibitor能提高H2O2损伤细胞的生存率，使其达到79.09％，与其他3组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 Blank组和NC组凋亡细胞较少，差异无统计学意义。H2O2组与Blank组和NC组相比，能明显诱导细胞凋亡（P＜0.05）。H2O2+AS-miR-1组细胞凋亡率明显低于H2O2组（P＜0.05），见表1、图1。

Fig.1 Cell apoptosis rate in each group图1 FCM检测24 h后各组细胞凋亡率

2.4 各组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达 Blank组和NC组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义。H2O2组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平明显低于Blank组和NC组（P＜0.01）。H2O2+AS-miR-1 组Bcl-2 mRNA的表达水平与H2O2组比较差异无统计学意义，但低于Blank组和NC组（P＜0.05）。H2O2+AS-miR-1组Bcl-2的蛋白表达水平比H2O2组高（P＜0.05）；与Blank组和NC组比较差异均无统计学意义，见表1、图2。

Fig.2 Western Blot of Bcl-2图2 Western Blot检测Bcl-2蛋白表达水平

3 讨论

近年来，对miRNA的研究已经成为生命科学领域中的一个重要方向。miRNA是一类17～25 nt长的内源性非编码单链小分子RNA，由一段具有发夹结构的70～80个核苷酸长度的单链RNA前体（pri-RNAs）在Dicer酶的剪切下生成。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性，通过部分互补或者完全互补结合到目的靶mRNA，特异性诱导靶基因mRNA降解和（或）抑制靶基因mRNA的翻译，参与多种生物学信号通路的调节。miRNA分布范围广泛，参与的生物学过程复杂，调控的靶基因众多。因此，研究miRNA的功能及作用机制有重要意义。

Zhao等[6]报道了miRNA在心脏发育中的关键作用，并提出miR-1具有肌细胞特异性，只在心肌和骨骼肌中表达。从此，miRNA在心血管领域的研究广泛开展，大量文献证实miRNA与心脏发育、心肌肥厚[7]、心律失常[5]、心肌纤维化、心力衰竭、心肌梗死、心肌梗死后血管生成[8]、动脉粥样硬化[9]等具有密切的关系。其中，关于miR-1的研究成为心血管领域的热点问题。高表达miR-1的细胞caspase-3活性升高、细胞凋亡明显，但其具体的促凋亡机制还没有完全阐明。针对不同的靶基因，miR-1作用的方式不同。研究表明miR-1不仅作用于抗凋亡因子HSP60/70的转录后水平，也作用于其转录水平，使得HSP60/70的蛋白和mRNA表达水平均降低，引起细胞凋亡；但对于靶基因IGF-1，miR-1仅在转录后水平发挥作用，使其蛋白表达水平降低，而mRNA表达水平无变化[10]。miR-1对caspase-3的蛋白和mRNA表达均没有影响，只影响其活性，使其活性升高。

本课题组用targetscan和miRBase软件预测到miR-1作用的一个重要靶基因为Bcl-2。前期工作显示，利用转染技术提高心肌细胞内的miR-1表达水平可以通过降低Bcl-2的mRNA和蛋白水平，引起细胞凋亡[11]。为了进一步研究miR-1在缺血心肌细胞凋亡中的作用，笔者用H2O2建立心肌细胞氧化应激损伤模型，观察体外合成的miR-1 inhibitor对心肌细胞的保护作用。结果显示，转染miR-1 inhibitor能部分逆转氧化应激引起的细胞凋亡现象，Bcl-2的蛋白表达水平明显升高，mRNA表达水平虽然有升高趋势，但与H2O2组差异无统计学意义。这一方面可能是由于研究样本量太小，实验误差较大造成；另一方面可能也说明miR-1 inhibitor主要是通过作用于Bcl-2的蛋白水平发挥细胞保护作用。还需要进一步扩大样本量进行验证。

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[2]Li C，Pei F，Zhu X,et al.Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial Infarction[J].Clin Biochem, 2012,45(10):727-732.doi:10.1016/j.clinbiochem.2012.04.013.

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（2013-10-17收稿 2014-03-27修回）

（本文编辑 魏杰）

Downregulation MicroRNA-1 Can Protect H2O2Injured Cardiomyocytes

ZHENG Junyi1,CAI Ying2,CONG Hongliang1,ZHOU Jin1
1 Department of Cardiology,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300222，China；2 Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin Neurosurgery Institute，Tianjin Cerebrovascular and Neurodegeneration Key Laboratory CONG Hongliang,E-mail：hongliangcong@163.com

ObjectiveTo investigate the protective function and mechanism of microRNA-1(miR-1)downregulation in H2O2injured cardiomyocytes.MethodsThe experiment was divided into 4 groups:Blank group,Negative Control group(NC),H2O2group and H2O2+AS-miR-1 group.Cells in blank group were not underwent any treatment.Cells in NC group were transfected with random miRNA fragment.H2O2and H2O2+AS-miR-1 groups were defined as H2O2injured cardiomyocytes without or with transfected antisense miR-1 oligonucleotide（AS-miR-1）.Real time PCR was used to test miR-1 transcription level,and cell vitality and apoptosis were analyzed by MTT and flow cytometry.The target gene of miR-1 was predicted by bioinformatics,then its mRNA transcription and protein expression level of Bcl-2 were detected by real time PCR and western blot respectively.ResultsThere is no significant difference of all index between Blank group and NC group.H2O2can induce cardiomyocyte injury,increase miR-1 level and rise apoptosis rate,reduce cell vitality and decrease Bcl-2 expression level.Transfection of AS-miR-1 can decrease cell apoptosis,increase cell vitality and enhance Bcl-2 expression level.ConclusionDownregulation of microRNA-1 can protect cardiomyocytes that was injured by H2O2through increasing anti-apoptosis factor Bcl-2 expression.

microRNAs;myocytes,cardiac;apoptosis;transfection;oxidative stress;hydrogen peroxide;miR-1

R542.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.001

国家青年自然科学基金（81303091）

1天津市胸科医院心内科（邮编300222）；2天津市环湖医院,天津市神经外科研究所，天津市脑血管与神经变性重点实验室

△通讯作者 E-mail：hongliangcong@163.com