盐酸美沙酮口服溶液微生物限度检查的方法学验证研究

严明娟 刘显玲

盐酸美沙酮口服溶液微生物限度检查的方法学验证研究

严明娟 刘显玲

目的进行盐酸美沙酮口服溶液的微生物限度检验方法的构建。方法按照2010年版《中国药典》（二部）的相关要求，开展微生物限度检查样品，分别采用常规法、培养基稀释法进行。结果常规法计数霉菌及酵母菌最为合适，但不能用于计数本品细菌；胆盐乳糖增菌培养基 100ml可应用于大肠埃希菌从盐酸美沙酮口服溶液的检查过程。结论培养基稀释法可测定细菌数，常规法可测定霉菌数及酵母菌数，能将药物抑菌成分的干扰问题彻底解决，从而使污染存活于药物中的菌落数得到可靠反映，具有较高的检出率。

微生物限度检查；常规法；培养基稀释法；盐酸美沙酮口服溶液

盐酸美沙酮口服溶液不仅在戒毒治疗方面应用广泛，而且在预防艾滋病方面也具有降低危害的效果。对于0.12%的防腐剂（山梨酸钾）非规定灭菌制剂，在药品微生物限度检查法的建立过程中，必须按照2010年版《中国药典》（二部）的相关要求，严格验证细菌、霉菌及酵母菌计数及控制菌检查的方法，以此对所采用方法的适应性进行确认[1]。现回顾报告如下。

1 材料与试药

1.1 药物 盐酸美沙酮口服溶液（云南省药物依赖防治研究所，规格：1ml:1mg，批号：101205、101206、101207各取100ml）。

1.2 菌种 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌。

1.3 培养基及稀释剂 由北京三药科技开发公司所提供的玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖增菌培养基、营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸、改良马丁培养基等培养基。PH710无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.4 仪器 DHP060霉菌培养箱（上海实验仪器厂有限公司）、100级SW-CJ-1B超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、YXQ-SG-41.280全自动立式电热压力蒸汽灭菌器（华线医用核子仪器有限公司）、PYX-DHS35X40.BS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、303A-2S型隔水式培养箱和远红外辐射干燥箱（萧山永发电器有限公司沪山实验仪器厂）。

2 实验方法

2.1 菌液制备

2.1.1 从生理盐水管取出35℃培养的1ml＋9ml 0.9%金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的24h营养肉汤培养物，稀释按照10-5～10-810倍操作，其细菌数大约为50～100cfu·ml-1，以备用计数活菌。

2.1.2 从灭菌生理盐水取出1ml+9ml经过35℃培养的 24h白色念珠菌改良马丁液体培养物，稀释按照10-6～10倍操作，其细菌数大约为50～100cfu·ml-1，以备用计数活菌。

2.1.3 将7d经过35℃培养的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物取出，然后加入5ml生理盐水洗下霉菌孢子，并用无菌试管加入经过滤的孢子悬液，再从生理盐水1ml+9ml 0.9%管中将其取出，稀释按照10-6～10倍操作，存有约为 50～100cfu·ml-1的细菌数，以其为计数活菌作准备。

上述株菌全部采用第三代培养物。

2.2 供试品溶液的制备 采取以本品10ml将1:10供试液取出后，将45℃ PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml加入。

2.3 验证细菌、霉菌及酵母菌菌落的计算方法

2.3.1 常规法 平皿中加入1:10供试液1ml，再加入20ml琼脂培养基，对其结果作培养观察。完成3次独立的平行试验作为验证试验，并对所有试验的各试验菌回收率分别进行计算。

2.3.2 培养基稀释法 在5个平皿中平均加入1:10供试液1ml，也就是0.2ml/皿，将营养琼脂培养基20ml和玫瑰红钠琼脂培养基完全注入后，观察最后的结果[2]。

2.3.3 测定回收率 ①试验组。完全将 1ml 50～100cfu·ml-1供试液与试验菌液注入。②菌液组。测定试验菌于所有菌株加入的情况。③进行对照组供试品的测定。仅加入供试液，采取与试验组大体相同的操作程序，对本菌数在供试品中的情况进行测定。④进行对照组稀释剂的测定。替代供试液可为PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，与试验组大体相同完成其它操作。

2.4 控制菌的检查 对大肠埃希菌的检查：可在100ml胆盐乳糖增菌培养基中加注入 1:10供试液10ml，并将大肠埃希菌液1ml一并加入，经过35℃下培养24h后再放入，把0.2ml培养物从中取出，其接种培养过程以培养基5ml MUG进行实施，可在35℃环境进行培养，于366nm紫外灯下各自进行5h、24h的观察，对照空白MUG培养基的情况。对荧光反应进行一一观察，然后滴入靛基质试液观察是否在液面有靛基质阳性的玫瑰红色现象呈现。应用金黄色葡萄球菌于阴性菌对照组。

3 结果

3.1 回收率测定 分别进行3次常规法和试验法得出结论：回收率达到70%以上的仅为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉，但枯草芽孢杆菌试验组菌除外。由此可以看出，常规法计数霉菌及酵母菌最为合适，但不能用于计数本品细菌（见表1、2）。

表1 细菌、霉菌及酵母菌的回收率测定结果(常规法)

表2 枯草芽孢杆菌的回收率测定结果(培养基稀释法)

3.2 控制菌检查结果 试验组阳性MUG和阳性靛基质可采用上述方法检查出来，大肠埃希菌也可从中检查出来。阴性MUG和阴性靛基质是从对照组检出阴性菌，并未检出金黄色葡萄球菌。由此可以得出，胆盐乳糖增菌培养基100ml可应用于大肠埃希菌从盐酸美沙酮口服溶液的检查过程（见表3）。

表3 大肠埃希菌检查结果

4 讨论

方法验证是对所采用的检查方法和检验条件下供试品的无抑菌作用做确认，从而充分检出供试品所污染的微生物。当微生物限度检查含有抑菌成分药物的过程中，对试验条件下供试品的抑菌作用本身能够有效排除提出要求其对染菌的限度检验不产生干扰作用，且被检微生物的生长繁殖正常。达到70%以上的细菌计数、霉菌和酵母菌计数方法验证的回收率是《中国药典》（二部）（2010年版）相关标准的规定内容。在本文，盐酸美沙酮口服溶液的方法验证试验，分别采用常规法和培养基稀释法，结果显示，常规法适用于检查大肠埃希菌、黑曲霉等，培养基稀释法是检查枯草芽孢杆菌唯一的方法，这是抑菌活性在供试品中一定程度的体现。因此，培养基稀释法可测定细菌数，常规法可测定霉菌数及酵母菌数，能将药物抑菌成分的干扰问题彻底解决，从而使污染存活于药物中的菌落数得到可靠反映，具有较高的检出率。

[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社,2007:223-2271.

R927.1

A

1673-5846(2014)02-0028-02

云南省药物依赖防治研究所，云南昆明 650228