Gas7在大鼠梨状皮质发育过程中的表达

黄 锐 刘 敏 侯良芹 熊克仁

（皖南医学院人体解剖学教研室，芜湖 241000）

Gas7基因是1998年Ju等［1］从去血清的小鼠成纤维细胞中分离出来的，属于Gas基因家族中的一员，但由于Gas基因家族各成员之间没有序列同源性，因此各自具有不同的生物学特性。Gas7可特异性高表达于大鼠小脑的浦肯野纤维细胞，并能促进PC12细胞向终末方向发育和分化［1，2］。目前已知Gas7广泛表达于软骨、肾脏、心脏、视网膜等部位，在神经系统中如脊髓、海马等部位也有表达［3－6］，但Gas7在梨状皮质发育过程中的表达国内外尚未见报道。梨状皮质作为嗅觉传导系统的初级皮质中枢，也参与癫痫［7］等疾病的病理过程，其作为边缘系统的组成部分与一些脑区有着广泛而复杂的联系，研究梨状皮质的发育特点及梨状皮质在发育中的调控因子有利于丰富其基因调控网络，同时也有助于解释梨状皮质相关疾病的病理过程及发病机制。

材料和方法

1.实验动物与分组

将孕鼠处死，取胚胎18.5天（E18.5）、E20.5大鼠，取生后当天（P0）、生后第7天（P7）、P14、P21和成年（Adult）大鼠。实验组大鼠分为E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21以及Adult共七个不同时期组，每组12只，其中6只用于RT－PCR实验，6只用于免疫组化实验。

2.主要实验试剂

山羊抗Gas7一抗购自Santa Cruz公司，生物素标记兔抗山羊IgG与HRP－DAB增强型显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，TRNzol－A＋总RNA提取试剂与Quant cDNA第一链合成试剂盒及PCR试剂盒均购自北京天根生化公司，大鼠Gas7和β－actin引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，D2000Marker购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3.RT－PCR方法

将E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21和 Adult组大鼠处死，取大鼠梨状皮质，按照RNA提取试剂盒说明书提取各组大鼠总RNA，通过紫外分光光度计检测各组RNA浓度，每组按1μg的RNA量按照逆转录试剂盒说明书转录成cDNA，放于－20℃冰箱备用。Gas7目的条带为492bp，其上游引物为5＇－AAGAAGAGTCTGGCCGATGA－3＇，其 下 游 引 物 5＇－CTCGACTGTGCTTTGGTTGA－3＇；β－actin作为内参，扩增后的目的条带为282bp，其上游引物为5＇－CAGGCACCAGGGCGT－3＇，下 游 引 物 为 5＇－ATGGCTGGGGTGTTGAAG－3＇。构建50μl PCR反应体系：10×Taq buffer（mg2＋Plus）5μl，dNTP mixture 4μl，上下游引物各1μl，cDNA 2μl，ddH2O 36.7μl和Taq DNA Polymerase 0.3μl。Gas7的扩增程序为：95℃预变性3min，后接34个循环，每一循环条件为94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s；β－actin的扩增程序为：95℃预变性3min，后接29个循环，每一循环条件为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s。每组取5μl扩增产物，以D2000Marker作为参照，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统对所得结果进行拍照，并测定各组不同时期大鼠梨状皮质Gas7和β－actin产物条带的光密度值（OD值），换算得出光密度校正值，即样品OD值/βactin OD值，并对所得数据进行统计学分析。

4.免疫组织化学方法

孕鼠和生后鼠按50mg/kg戊巴比妥钠深度麻醉后，从孕鼠腹中取出胚胎鼠，E18.5至P0鼠直接断头取脑，P7至成年鼠经左心室快速滴注0.9%生理盐水，再快速输入1%多聚甲醛与1.25%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液进行灌注固定，后开颅取脑，入4℃4%多聚甲醛固定液中固定24h，常规经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，取梨状皮质区进行连续冠状切片，片厚5μm，60℃烤片2h，备染。将组织切片脱蜡至水，3%H2O2封闭12min，以灭活内源性过氧化物酶；双蒸水洗三次，每次5min，0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复10min，自然冷却至常温；0.02mol/L PBS洗3次，每次5分钟，5%BSA 37℃封闭30min；甩去多余液体，不洗，滴加山羊来源Gas7一抗（1∶100），4℃冰箱过夜；37℃复温1h，0.02mol/L PBS洗3次，每次5min，滴加生物素标记的兔抗山羊二抗IgG（1∶200），37℃孵育30min；0.02mol/L PBS洗3次，每次5min，滴加SABC 37℃孵育30min；0.02mol/L PBS洗4次，每次5min，DAB显色5－10min，依次经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，Olympus显微镜拍片。每只大鼠取2张400倍视野梨状皮质部位切片，测算单位面积平均灰度值和阳性细胞数，分别取平均值作为该大鼠的平均灰度值和阳性细胞数值。

5.统计学处理

用SPSS18.0软件进行统计分析，数值变量资料以±s表示，对结果进行方差分析，组间比较采用t检验，检验水准α＝0.05，P＜0.05作为判定有统计学意义的依据。

结 果

1.RT－PCR检测各期大鼠梨状皮质Gas7核酸的表达

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图像（图1）所示，在各组均可见Gas7 492bp条带和β－actin 282bp条带，条带清晰，各组表达稳定。从对各组Gas7与β－actin条带光密度校正值的半定量结果分析所得曲线图（图2）可以看出，从E18.5到P14呈增强趋势，在P14达到峰值，而P14到Adult则呈下降趋势（P＜0.05）。说明Gas7核酸在P14时大鼠梨状皮质表达最强，之后表达减弱。

图1 大鼠梨状皮质不同时期 Gas7核酸琼脂糖电泳图1：DNA－Marker 2：Adult 3：P21 4：P14 5：P7 6：P0 7：E20.5 8：E18.5Fig.1 Gas7nucleic acid in the piriform cortex of rat during different developmental stages on agarose electropherogram.1：DNA－Marker 2：Adult 3：P21 4：P14 5：P7 6：P0 7：E20.5 8：E18.5

图2 Gas7核酸在大鼠梨状皮质不同时期的表达 ；＊：与前一时间点相比，P＜0.05Fig.2 The Expression of Gas7in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊：Compared with former time point，P＜0.05

2.免疫组织化学方法检测Gas7蛋白在各期大鼠梨状皮质的分布（图3－5）

E18.5和E20.5时梨状皮质出现棕黄色Gas7免疫阳性颗粒沉积，表现为斑片状或絮状结构，着色较淡；P0时在梨状皮质出现Gas7免疫阳性细胞轮廓，细胞境界不太清晰，隐约可见细胞突起，着色加深（P＜0.05）；至P7时，出现形态较为规则Gas7免疫阳性细胞，并可见细胞突起，细胞体积较大，主要为细胞胞浆、胞膜以及细胞突起着色，着色深于P0（P＜0.05），细胞核不着色呈空泡状；与P7比较，P14时Gas7免疫阳性细胞数量明显增多（P＜0.05），细胞体积增大，轮廓清楚，细胞突起多见，结构清晰，细胞胞浆、胞膜和突起深染，着色深于之前几个时期（P＜0.05）；与P14相比，P21时 Gas7免疫阳性细胞数减少，细胞着色减弱（P＜0.05），突起有所减少，细胞形态变化不明显；到Adult时，Gas7免疫阳性细胞数目少于P21（P＜0.05），突起数目较少。

图3 大鼠不同发育时期梨状皮质Gas7免疫阳性产物的平均灰度值；﹡：与前一时间点相比，P＜0.05Fig.3 Gas7immunoreactive products average gray value in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊：Compared with former time point，P＜0.05

图4 大鼠不同发育时期梨状皮质Gas7免疫阳性细胞数；﹡：与前一时间点相比，P＜0.05Fig.4 Gas7positive cells in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊ ：Compared with former time point，P＜0.05

图5 Gas7在不同发育时期大鼠梨状皮质中的分布，SABC法×400。A～G：E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21和Adult时，Gas7在梨状皮质的表达；标尺A～G＝50μmFig.5 Distribution of the Gas7immunoreactivities in the piriform cortex of rat during different developmental stages.SABC immunohistochemical staining×400.A～G：Expression of Gas7in the piriform cortex of rats on E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21and Adult.A～G bar＝50μm

讨 论

梨状皮质位于大脑腹侧面的外侧端，在嗅沟和外侧嗅束之间，属于大脑边缘系统结构。在形态上，梨状皮质分为前部和后部，两者之间的边界位于前连合水平，梨状皮质前部发出的纤维向尾部投射分为浅深两层，浅层经分子层投射至内嗅皮质，深层的纤维投射到梨状皮质深部以及杏仁基底核与外侧核，两部分又可向内侧投射纤维至嗅结节、斜角带核、连合前海马、下丘脑外侧区和视前外侧区［8］。有研究报道［9］嗅球僧帽细胞层发出的纤维，直接投射到同侧的梨状皮质区，并且梨状皮质还发出远心纤维，经外侧嗅束注入嗅前核与嗅球的内颗粒层。梨状皮质与周围脑区广泛的纤维联系是其行使正常的生理功能和参与多种疾病病理过程的结构基础，梨状皮质在发育过程中其神经元的迁移、突起的延伸、突触的构建受到多种基因的调控，因此发掘梨状皮质在发育过程中新的调控因子不但有利于丰富其基因网络甚至可以为梨状皮质相关疾病提供潜在的治疗靶点。

本实验通过RT－PCR法对Gas7核酸的表达和免疫组织化学染色法对Gas7蛋白组织学定位进行观察，结果表明大鼠梨状皮质在各个时期均有Gas7表达，但在P14时表达最强。梨状皮质的神经元是由室管膜下层的神经母细胞通过增殖、分化和迁移演变而来。这些神经元到达预定位置后，还将伴随轴突的延伸、突触的构建，从而与其他神经元之间建立纤维联系，这些过程一直要持续到生后2～3周［10］。神经元轴突生长、运动、延伸和突触的构建等生物学过程是由细胞骨架所介导的。神经元轴突顶端的生长锥伸出的片状伪足和丝状伪足都含有纤维性肌动蛋白，它们与肌动蛋白分子结合成细胞骨架，具有高度的动态性，是轴突生长的结构基础［11］。Gas7作为肌动蛋白结合蛋白，与PSTPIP家族具有同样的结构［12］，即羧基端的双螺旋（coiled－coil，CC）结构域，其可与F－actin结合，使F－actin向细胞膜处聚集，并与胞膜下丰富的纤维丝聚集交联成网，并进一步诱发突起的延伸、突触体积的增大，在实验中观察到Gas7免疫阳性产物呈棕黄色颗粒状主要沉积于神经元胞膜和胞浆中。目前认为Gas7与大多数PCH（Pombe Cdc15homology）蛋白具有同样的结构域［13］，即FCH 结构域（Fes/CIP4Homology），具有FCH结构域的蛋白往往能够调节细胞骨架的重构，并能参与细胞内囊泡运输及胞吞作用［14］，提示Gas7可能具有调节细胞骨架重构及细胞内囊泡运输等生理过程。Chuck等［15］通过研究发现人类Gas7蛋白有Gas7a和Gas7b两个亚型，其中Gas7a基因具备FCH结构域，能够诱发生长锥中片状伪足的形成，进一步参与细胞骨架的重组；Gas7b基因含有WW和FCH结构域，能够诱发生长锥中丝状伪足的形成，可以与其他蛋白结构域连接参与细胞信号的转导，并调节细胞骨架的重构，由此可见Gas7作为肌动蛋白依赖蛋白或肌动蛋白相关蛋白可能在生长锥的形成和动态性方面起着重要的作用［16］。

本实验结果提示P14时梨状皮质发育达到高峰，神经元迁移已基本完成，细胞形态也基本稳定，P14以后至成年，梨状皮质神经元发育接近成熟，Gas7免疫阳性产物表达也逐渐减弱，可见Gas7在梨状皮质的表达与梨状皮质的发育趋势呈动态相吻合的特点，提示了Gas7可能参与了梨状皮质神经元的迁移、突起的延伸和突触构建等方面的调控，其具体的调控机制还有待于进一步研究。

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