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食管鳞状细胞癌中Sox2和β-catenin的表达及其临床意义

2014-07-05王晓彦吴继锋

关键词:外膜鳞状食管

王晓彦 吴继锋

(1安徽医科大学病理学教研室,合肥 233032;2蚌埠医学院临床医学二系,蚌埠 233030)

食管癌(Esophageal cancer,EC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一[1],其发生发展涉及多个基因多个过程,到目前为止其发病机制仍不清楚。在过去的20年其诊断和治疗水平有了显著提高,但5年存活率仍徘徊在5%和20%之间[2,3]。因此,寻找食管鳞状细胞癌早期诊断及预后判断的分子标志尤其重要。

干细胞转录调控因子Sox2是调控胚胎发育的关键因子,在胚胎发育早期对维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新具有关键的调控作用[4]。据报道Sox2在乳腺癌、胸腺瘤、前列腺癌和肝癌等肿瘤组织中表达升高[5-8]。LiX 等研究发现,Sox2通过激活 Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤转移[9]。β-连环素(β-catenin,β-cat)是 WNT 信号通路关键的传递子,主要位于胞膜,在有 Wnt配体存在时细胞内游离的β-catenin聚集并易位至细胞核内,与核内转录因子——T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)结合,刺激一系列靶基因的转录,进而促进肿瘤的发生[10]。

研究采用免疫组化染色方法检测ESCC及其癌旁正常食管黏膜组织(对照)中Sox2和β-catenin蛋白表达水平,并分析二者与ESCC患者临床病理因素和预后之间的关系,本研究对深入理解ESCC和预后判断有一定理论指导意义。

材料和方法

1.临床资料

随机选取蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2008-2009年存档石蜡包埋标本90例,其中男51例,女39例;年龄为36-81岁(中位年龄58.6±6.2);解剖部位:上段9例,中段55例,下段16例;大体类型:髓质型31例,溃疡型43例,蕈伞型14例和缩窄型的2例;肿瘤直径<5.0cm的41例,≥5.0cm的49例;分化程度:高分化23例,中分化30例和低分化37例;淋巴结转移者48例,未转移者42例;浸润至外膜76例,未浸润外膜层14例;临床Ⅰ-Ⅱ期35例,Ⅲ-Ⅳ期55例。所有患者术前均未接受放、化疗,经过患者及其蚌埠医学院人体试验伦理道德委员会知情同意。

2.免疫组化主要试剂和染色步骤

兔源多克隆抗体 Sox2(ab97959)和β-catenin(ab16377)购自Abcam公司,DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。免疫组化染色[11]:所有石蜡包埋组织连续切片数张,4-5μm/张,置于二甲苯溶液及梯度乙醇中脱蜡至水洗。操作步骤按试剂盒说明书进行,内源性过氧化物酶活性用含3%的H2O2甲醇封闭,室温下置10min;95℃孵育10min进行抗原修复,PBS冲洗;山羊血清室温下封闭20min;一抗孵育4℃过夜,PBS冲洗,羊抗兔二抗室温孵育30min。

3.免疫组化染色结果评判

免疫组化染色结果由2名资深病理医师阅片评定。Sox2主要表达于对照及ESCC瘤细胞的胞核;β-catenin主要表达于正常食管上皮胞膜/胞浆及ESCC瘤细胞的胞核/胞浆,如果在正常食管组织出现β-catenin核表达则记为阳性。采用阳性细胞的数量及细胞着色强度双评分半定量法记分[11]。每张切片随机观察10个高倍视野,每个视野计数200个细胞,阳性细胞数量按照以下方法:0(无阳性);1(<10%);2(10-35%);3(>35-75%)和4(>75%);细胞着色强度:1(不着色);2(浅黄色);3(棕黄色)和4(棕褐色)。两者结果相乘分值0-1为阴性,≥2为阳性。

4.总体生存时间

总体生存时间(Overall survival time,OS)定义为自ESCC患者确诊至因该病导致死亡或失访之间的时间。入选病例随访至患者死亡或截止到2013年8月31日,随访时间为3-108个月,其中有6位患者失访。

5.统计学分析

χ2检验分析比较Sox2和β-catenin在ESCC及对照组织中表达的差异和二者与ESCC患者临床病理因素之间的关系;Spearman等级相关分析比较Sox2与β-catenin之间的关系,P<0.05定义为差异有统计学意义。

结 果

1.Sox2在ESCC中的表达及其与临床病理因素之间的关系

Sox2呈棕褐色颗粒状,主要表达于ESCC及对照组织细胞的胞核,胞浆仅少量表达(Fig 1A,1B)。90例ESCC组织中有56例阳性表达,阳性率为62.22%,显著高于对照组织的阳性率35%(7/20)(P<0.05)。Sox2与ESCC患者淋巴结转移、外膜浸润和PTNM分期相关,淋巴结转移者Sox2阳性率为83.33%(40/48),未转移者Sox2阳性率为38.10%(16/42);外膜浸润者Sox2阳性率为82.61%(38/46),未浸润者Sox2阳性率为40.91%(18/44);PTNM分期Ⅰ-Ⅱ期ESCC组织中Sox2阳性率为20%(7/35),Ⅲ-Ⅳ期为75.53%(49/55),组间比较差异有统计学意义(P<0.05);Sox2与ESCC患者性别、年龄、部位、大体类型、肿瘤直径和组织学分型之间差异无统计学意义(P>0.05,表1)。

2.β-catenin在ESCC中的表达及其与患者临床病理因素之间的关系

β-catenin呈棕褐色颗粒状,在正常情况下仅表达于正常食管黏膜上皮细胞的胞膜,当其表达缺失或异位至胞浆/胞核时,即表达异常定义为阳性。β-catenin在ESCC组织主要表达于胞核/浆(Fig1CE)。90例ESCC组织中有60例阳性表达,阳性率为66.67%,显著高于对照组织的40%(8/20)(P<0.05)。β-catenin与 ESCC患者淋巴结转移、外膜浸润和PTNM分期相关,淋巴结转移者β-catenin阳性率为79.17%(38/48),未转移者阳性率为52.38%(22/42);外膜浸润者β-catenin阳性率为78.26(36/46),未浸润者阳性率为54.55%(24/44);PTNM分期Ⅰ-Ⅱ期ESCC组织中β-catenin阳性率为25.71%(9/35),Ⅲ-Ⅳ期为92.73%(51/55),组间比较差异有统计学意义(P<0.05);β-catenin与ESCC患者性别、年龄、部位、大体类型、肿瘤直径和组织学分型之间差异无统计学意义(P>0.05,表1)。

表1 Sox2和β-catenin与食管鳞状细胞癌患者临床病理因素之间的关系(n=90)Table1 Association of Sox2andβ-catenin with clinicopathologic characteristics of patients with ESCC(n=90)

3.ESCC组织中Sox2和β-catenin表达之间的关系

Spearman相关分析显示ESCC组织中Sox2与β-catenin蛋白表达水平之间呈正相关,r=0.71,(P<0.001,表2)。

表2 食管鳞状细胞癌中Sox2和β-catenin表达之间关系(n=90)Table2 Correlation of Sox2andβ-catenin expression in ESCC(n=90)

4.Kaplan-Meier生存分析

Kaplan-Meier生存分析显示,Sox2阳性表达ESCC患者5年生存率为8.93%(5/56),显著低于Sox2阴性患者的70.59%(24/34)(Log-rank=67.092,P<0.001)(图2)。

图1 正常食管黏膜(对照)和ESCC组织中Sox2和β-catenin的表达(Elivision,×400)。A.对照组织细胞核Sox2阳性表达。B.ESCC组织瘤细胞核Sox2阳性表达。C.正常食管鳞状上皮基底层和棘细胞层细胞膜β-catenin的正常表达。D.正常食管鳞状上皮基底层和棘细胞层细胞浆β-catenin的异位表达。E.ESCC组织瘤细胞核β-catenin的胞浆/核的异位表达。Fig.1 Immunohistochemical expression of Sox2andβ-catenin in normal esophageal mucosa(control)and ESCC tumor cells(Elivision,×400).A.Normal epithelium of the esophageal mucosa.Abberant positive immunoreactivity of Sox2protein is observed in the nucleus of the control cells.B.Abberant positive immunoreactivity of Sox2protein in the nucleus of ESCC tumor cells.C.Normal expression ofβ-catenin protein in the membrane of control cells.C.Normal epithelium of the esophageal mucosa.Positive immunoreactivity is observed on the plasma membrane of the cells in the basal and parabasal layers.No counterstaining was performed.D.Abberant positive immunoreactivity ofβ-catenin protein is observed on the cytoplasm of the cells in the basal and parabasal layers(loss in the membrane of control cells).E.Abberant positive immunoreactivity ofβ-catenin protein in nucleus and cytoplasm of ESCC tumor cells.

图2 Sox2阴性和阳性表达食管鳞状细胞癌患者总体生存曲线(n=90)。Fig.2 The overall survival curve of patients with esophageal squamous cell carcinoma with Sox2protein positive or negative expression(n=90).

讨 论

Sox2是Sox(SRY related HMG box)基因超家族成员之一,是一类SRY(sex determination region of Y chromosome)相关基因家族,参与胚胎发育和细胞生长调控[12-14],SRY基因位于Y染色体上接近常染色质的在35kb左右的区域内,在进化上高度保守,它所编码的蛋白质在高速泳动区(high-mobile group,HMG)中含有一段有79个氨基酸残基的DNA结合区域(DNA binding domain,DBD),因此被命名为HMG-box[15]。Sox基因家族对下游的靶基因发挥抑制或者激活调节作用,就是通过特定的DNA序列与HMG结构相互结合而得以完成的[16]。Sox2基因定位于人3号染色体上,全长2518bp,编码319个氨基酸,对中枢神经系统特别是垂体、前脑、眼睛晶状体和内耳的形成有重要的调控作用[17]。

最近研究报道潜能相关转录因子Sox2在多种肿瘤中表达,和它在胚胎干细胞中的作用相似,Sox2表达升高的肿瘤细胞分化程度较低[5]。Sox2可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路刺激上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)促进肿瘤转移[9]。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、发育和分化的关键通路之一,该通路主要由信号分子启动、分子传递、靶基因转录活化等几个重要环节组成[18]。β-catenin是一种多功能细胞骨架蛋白,主要位于细胞膜。既能与E-cadherin结合,介导同型细胞间的黏附,维持组织结构的完整性和极性,又是 Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子,它以信号分子及“促癌因子”的角色参与肿瘤发生和发展[19]。

经典的Wnt/β-catenin信号通路在没有Wnt配体时,β-catenin、大肠腺瘤样蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)及轴蛋白(Axin)形成四元降解复合体 GSK-3β/APC/Axin/β-catenin启 动 β-catenin 降 解[10]。 当 体 内 的稳态失衡时,比如Sox2表达升高、癌基因激活或抑癌基因失活时,细胞内游离的β-catenin聚集并易位至细胞核内与TCF/LEF结合形成转录复合体βcatenin-TCF/LEF,激活该信号通路,刺激一系列靶基因如c-myc、c-jun和 CyclinDl等的表达,进而促进肿瘤的进展[10,19]。

实验结果显示Sox2和β-catenin在ESCC组织中表达升高(P<0.05),二者之间呈正相关,r=0.71(P<0.05),且Sox2和β-catenin阳性表达的ESCC患者更容易发生淋巴结转移和外膜浸润,具有更迟的PTNM分期(P<0.05)。我们结果和Long等报道在Sox2在胃肠道鳞状细胞癌中的表达水平显著升高一致[20]。Kaplan-Meier生存分析显示Sox2阳性ESCC患者的5年生存率(8.93%)显著低于阴性患者(70.59%)(P<0.05)。我们推测Sox2在ESCC的异常表达,引起 Wnt/β-catenin信号通路异常激活,一方面通过EMT使上皮细胞丧失上皮表型和极性,减少与周围细胞和细胞外基质的接触,运动、迁移能力增强;另一方面刺激该通路靶基因的表达,从而使ESCC更容易发生淋巴结转移和外膜浸润,患者预后较差。

综上所述,Sox2通过调控β-catenin转录从而激活 Wnt/β-catenin信号通路是ESCC发生淋巴结转移和外膜浸润的分子基础。联合检测Sox2和βcatenin可以作为ESCC预后判断的指标,也可以为研究通过Sox2或β-catenin途径治疗ESCC提供新的思路。

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