ING4、PHDs以及HIF－1α在低氧性肺动脉高压大鼠中的表达变化

蒋永亮 聂 金 刘 蕾 戴爱国

（湖南省老年医院呼吸疾病研究所，长沙 410001）

慢性肺源性心脏病（简称肺心病）是严重危害健康的常见病。在我国85%的肺心病由慢性阻塞性肺疾病（COPD）发展而来。其中肺动脉高压是肺心病的关键发病环节，而缺氧又是形成肺动脉高压的重要因素，因此缺氧性肺动脉高压（HPH）的发病机制及防治一直是人们研究的热点。本课题组研究发现，肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的凋亡与增殖失衡是低氧性肺血管重塑发生发展的重要细胞机制［1，2］，而低氧诱导因子－1（hypoxia－inducible factor－1，HIF－1）则是导致此平衡失调的重要分子机制［3－5］。HIF－1表达分布、时相及对目标基因iNOS、VEGF、HO－1等表达的调控均有明显差异，提示HIF－1是低氧性肺血管重塑形成中调控目标基因表达的“分子开关”［6］。

HIFs家族是由不同的α亚基（HIF－1α、HIF－2α、HIF－3α）和共同的β亚基构成的异源二聚体转录因子。HIF－α亚单位氧依赖性降解有赖于其ODD区特定脯氨酸残基羟基化，羟基化后的HIF－α可 与 肿 瘤 抑 制 蛋 白 pVHL（von Hippel－Lindau tumour suppressor protein）结合，通过E3蛋白酶体途径快速降解。有研究表明，氧感受器－HIF脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase domain－containing proteins，PHDs）是催化特定脯氨酸残基羟基化的关键，是 HIF－α氧依赖性降解的限速酶［7］。

在人类共有三种2－酮戊二酸依赖的脯氨酰羟化酶被确认（PHD1－3）。PHDs催化 HIF－1α亚基402和（或）564位脯氨酰残基羟基化是其与pVHL结合的识别信号，二者的结合启动了HIF－1α的降解过程。研究发现多种生物分子可通过不同途径来调节PHDs的表达与酶活性从而影响HIFs的表达［8］。

新发现一种候补肿瘤抑制蛋白ING4（Inhibitor of growth family member 4）具有与PHD家族相类似的锌指结构并参与肿瘤生成，细胞凋亡，DNA修复以及细胞周期控制等一系列过程［9］。通过酵母双杂交作用证明ING4可与PHD2相结合，进而调节HIFs的转录活性。

研究以大鼠HPH模型为对象，探讨肺动脉高压形成过程中ING4表达变化的规律及和PHDs、HIF－α之间的相关关系，阐明ING4调控PHDs蛋白表达与酶活性在HPH发生、发展过程中的作用。

材料和方法

1.实验动物

健康雄性二级Wistar大鼠40只，体重270±30 g，10－12w，由湖南中医学院实验动物中心提供，清洁级，证书号：036，发证单位：湖南省实验动物管理委员会。

2.实验方法

2.1 大鼠缺氧性肺动脉高压模型的复制及分组

按随机数字法将大鼠分为5组，每组8只：对照组（对照组），缺氧3d、7d、14d和21d组（H3、H7、H14和 H21组）。按本室报道的方法［10］，每天8h间断缺氧（氧浓度10%±0.5%，气压与大气压相等）。对照组置于正常氧浓度的空气舱内，其余各饲养条件完全相同。

2.2 肺动脉压力测定

大鼠经1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔内麻醉后，按徐平等报道方法［11］通过压力传感器接上Powerlab（美国匹兹堡AD器械有限公司）连续测压并计算大鼠平均肺动脉压力（mean pulmonary artery pressure，mPAP）。

2.3 右室肥厚指数（RVHI）的测定

肺动脉测压后将大鼠放血处死，取出心脏置4%中性甲醛固定48h，沿房室沟切除心房及大血管根部，再沿到后室间沟将右心室游离壁分离，吸干水分后分别称取右室（RV）和左室＋室间隔（LV＋S）的重量，计算右室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index，RVHI）反映右心室肥厚的变化。

2.4 肺小血管形态学分析

大鼠左上侧肺组织做石蜡切片，每只大鼠随机选3张肺组织切片，每张切片选取断面积较圆的直径100μm左右肺细小动脉5支，用病理图像分析软件（朗珈PAS9000病理图像分析系统）测定肺动脉管壁面积/管总面积（WA%），管腔面积/管总面积（LA%），作为肺小血管重塑指标［12］。

3.HIF－1α、PHDs、ING4原位杂交及结果分析

地高辛标记的多相寡核苷酸探针（武汉博士德生物工程有限公司提供）序列：

参照文献［2］，取大鼠左下肺组织和临床肺组织标本经4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS固定2h，常规脱水、浸蜡、包埋；石蜡切片常规脱蜡至水，胃蛋白酶37℃消化20min以暴露mRNA核酸片段，38℃湿盒内预杂交2h后加杂交探针，盖上硅化盖玻片置38℃湿盒内杂交16h；在干燥环境中继续杂交2h，洗涤、封闭，按说明书依次加入地高标记兔抗大鼠抗体、生物素化羊抗兔抗体、SABC（链亲和素－过氧化物酶溶液），DAB（二甲氨基偶氮苯）显色；苏木素复染，脱水透明常规封闭观察。以不含探针的杂交液代替探针作阴性对照，在显微镜下根据着色程度判定阳性强度：（1）阴性（－）：无黄色；（2）弱阳性（＋）：淡黄色；（3）阳性（＋＋）：黄色；（4）强阳性（＋＋＋）：深黄色或黄褐色。标定阴性背景颜色和阳性信号颜色，用肺动脉壁图像分析软件检测肺细小动脉管壁平均吸光度（absorbance，A），作为衡量阳性信号强弱的指标。

4.HIF－1α、PHDs、ING4免疫组织化学检测

参照文献［13］，取大鼠左上侧肺组织和临床肺组织标本经中性缓冲甲醛固定12h，常规脱水，浸蜡、石蜡包埋；加50μl过氧化酶阻断溶液室温下孵育10min，0.125%胰蛋白酶37℃处理20min行抗原修复，非免疫动物血清室温下孵育5min，加一抗：兔抗大鼠多克隆抗体，1∶150稀释。4℃孵育过夜，PBS冲洗，然后按试剂盒说明依次滴加二抗，SABC，DAB显色，苏木素复染，中性树脂胶封片观察，阳性结果（主要在胞浆）显棕黄色，以PBS代替一抗作阴性对照。每只大鼠取2张肺组织切片，每张切片随机选取直径100－150μm的肺动脉3支，管壁各指标蛋白相对含量检测同上。

5.Western blot检测肺动脉 HIF－1α、PHDs、ING4蛋白质表达

取大鼠肺内动脉，剪碎加入1mL改良RIPA裂解液，冰浴条件下匀浆；4℃10 000g离心，弃除沉淀，上清液即为总蛋白。每孔加入等量蛋白质样品，7.5%十二烷基硫酸钠－丙烯酰胺凝胶200伏恒压电泳后，转印至硝酸纤维膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h后，与1∶1 000稀释的一抗（购自Santa Cruz公司）4℃温育过夜。封闭液漂洗后加入1∶2 000稀释的二抗（公司同上），室温下摇床杂交1h。漂洗后增强化学发光法发光，X线胶片显影，图像分析系统（上海Tanon Gis22010）对扩增产物条带吸光度半定量，计算待测条带的吸光度与内参照β－actin的吸光度比值。

6.RT－PCR测肺动脉中HIF－1α、PHDs、ING4mRNA

取大鼠肺动脉，按说明书用TRIZOL试剂（上海生工）提取总RNA，逆转录后进行PCR，扩增引物由上海生工公司合成，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，适宜温度退火30s，72℃延伸60s，反应适当循环后72℃延伸10min。RTPCR产物经1.5% 的琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙啶）电泳，凝胶图像分析系统（上海Tanon Gis22010）对扩增产物条带吸光度半定量，计算待测条带的吸光度与内参照β－actin的吸光度比值。

7.统计学处理

计量资料数据均采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.5软件，多个样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数组间比较采用q检验；相关性分析采用直线相关回归法。P＜0.05认为差异有显著性，P＜0.01认为差异有高度显著性。

结 果

1.不同缺氧时间对低氧性肺动脉高压模型大鼠mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑的影响

实验结果显示，mPAP从缺氧7d起较对照组明显增高（P＜0.05），14d达高水平，21d保持在高水平；RVHI则从缺氧14d起较对照组明显升高（P＜0.05），已形成右心室肥厚。光镜下缺氧7d可见直径100μm左右的小动脉中层平滑肌增生，管壁变厚，管腔变窄，缺氧14d和21d平滑肌增生显著，管腔进一步狭窄。（表1）

表1 不同缺氧时间对低氧性肺动脉高压模型大鼠mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑的影响Table1 Histological and non－histological parameters for rats exposed to normoxia or hypoxia

2.不同缺氧时间对肺小动脉壁ING4mRNA及蛋白的表达的影响

原位杂交显示（Table2），对照组大鼠肺小血管ING4mRNA呈弱阳性表达，缺氧3d后开始增高，缺氧7d达高峰，缺氧14d和21d表达下降但仍高于对照组（Fig.4）。RT－PCR显示肺动脉ING4mRNA表达与原位杂交变化趋势一致（Fig.1）。免疫组化显示对照组大鼠肺小血管壁ING4缺氧7d表达明显增高，缺氧14d 达高峰（Table2，Fig.3）。Western blots显示ING4蛋白变化趋势与免疫组化变化趋势一致（Fig.2）。

表2 不同缺氧时间对肺小动脉壁ING4和HIF－1αmRNA及蛋白的表达的影响Table2 Effects of different hypoxia time periods on expression of HIF－1αand ING4in pulmonary artery of rats.

图1 不同缺氧时间对肺小动脉ING4、HIF－1α和PHD1－3mRNA的表达的影响Fig.1 Reverse transcription－polymerase chain reaction analysis of ING4、HIF－1αand PHD1－3mRNA levels in rat lung arteries during normoxia（control）and hypoxia（3，7，14and 21d）.The amplification ofβ－actin was used as a control.

图2 不同缺氧时间对肺小动脉ING4、HIF－1α和PHD1－3蛋白的表达的影响Fig.2 Western blot analysis of ING4、HIF－1αand PHD1－3levels in rat lung arteries during normoxia（control）and hypoxia（3，7，14and 21d）.The amplification ofβ－actin was used as a control.

图3 不同缺氧时间对肺小动脉ING4蛋白的表达的影响Fig.3 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor ING4protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）.DAB，×400.

图4 不同缺氧时间对肺小动脉ING4mRNA表达的影响Fig.4 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor ING4mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure1dwith administrati to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E），×400.■

图5 不同缺氧时间对肺小动脉HIF－1αmRNA表达的影响Fig.5 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor（HIF）－1αmRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure1dwith administrati to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

图6 不同缺氧时间对肺小动脉HIF－1α蛋白表达的影响Fig.6 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor（HIF）－1αprotein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

图7 不同缺氧时间对肺小动脉PHD1mRNA表达的影响Fig.7 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）1mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E），or hypoxia for 21d

图8 不同缺氧时间对肺小动脉PHD1蛋白表达的影响Fig.8 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein （PHD）1protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d

3.不同缺氧时间对肺小动脉壁HIF－1αmRNA及蛋白的表达的影响

RT－PCR及 原 位 杂 交 显 示 （Table2），HIF－1α mRNA在缺氧3d和7d相对量无明显变化，缺氧14d后表达略增高（P＜0.05）（Fig.1，5），主要见于肺小动脉中膜平滑肌细胞和内膜细胞。Western blot中HIF－1α蛋白在缺氧3d组蛋白质明显升高，缺氧7d达高峰，此后保持高水平（Fig.2）。免疫组化示HIF－1α蛋白对照组支气管上皮呈阳性表达，缺氧3d肺小动脉中膜和内膜明显升高，7d达到高峰（Fig.6），随后缺氧14d和21d组水平下降。

4.不同缺氧时间对肺小动脉壁PHDs mRNA及蛋白的表达的影响

原位杂交（Table3）显示，对照组大鼠肺小血管PHD1mRNA呈阳性表达（Fig.7），缺氧后与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。RT－PCR显示肺动脉PHD1mRNA表达与原位杂交变化趋势一致（Fig.1）。免疫组化显示对照组大鼠肺小血管壁PHD1呈阳性表达，缺氧3d、7d后无明显变化，缺氧14d较对照组显著下降（P＜0.05），缺氧21d维持较低水平（Fig.8）。Western blot显示PHD1蛋白变化趋势与免疫组化变化趋势一致（Fig.2）。

原位杂交显示，对照组大鼠肺小血管PHD2mRNA呈弱阳性表达，缺氧3d增高，缺氧14 d达高峰，缺氧21d保持高水平（Fig.9）。RT－PCR显示肺动脉PHD2mRNA表达与原位杂交变化趋势一致（Fig.1）。免疫组化显示对照组大鼠肺小血管壁PHD2缺氧3d表达增高，缺氧14d达高峰，缺氧21d保持较高水平（Fig.10）。Western blots显示PHD2蛋白变化趋势与免疫组化变化趋势一致（Fig.2）。

表3 不同缺氧时间对肺小动脉壁PHDs mRNA及蛋白的表达的影响Table3 Effects of different hypoxia time periods on expression of PHDs in pulmonary artery of rats

原位杂交显示，对照组大鼠肺小血管PHD3mRNA呈弱阳性表达，缺氧3d增高，缺氧14 d达高峰，缺氧21d保持高水平（Fig.11）。RTPCR显示肺动脉PHD3mRNA表达与原位杂交所观察到的肺小血管mRNA变化趋势一致（Fig.1）。免疫组化显示对照组大鼠肺小血管壁PHD3呈弱阳性表达，缺氧3d表达增高，缺氧7d保持高水平，缺氧14d和21d略有下降但仍高于对照组（Fig.12）。Western blots显示PHD3蛋白变化趋势与免疫组化变化趋势一致（Fig.2）。

5.ING4蛋白质与 HIF－1α、PHDs、mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑蛋白质相关性

直线相关分析表明，在缺氧组大鼠中MORG1蛋白质与 HIF－1α、PHD3蛋白质及 mPAP、RVHI、WA%呈正相关，ING4蛋白质与HIF－1α蛋白质及mPAP、RVHI、WA%呈负相关（Table4）。

表4 ING4蛋白质与HIF－1α、PHDs、mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑蛋白质相关性分析Table4 Linear correlation analysis between ING4proteins and HIFs－α、PHDs proteins，RVHI，mPAP，WA%，LA%，PAMT

图9 不同缺氧时间对肺小动脉PHD2mRNA表达的影响Fig.9 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）2mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）DAB，400×.

图10 不同缺氧时间对肺小动脉PHD2蛋白表达的影响Fig.10 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）2protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

图11 不同缺氧时间对肺小动脉PHD2mRNA表达的影响Fig.11 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein （PHD）3mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）DAB，400×.

图12 不同缺氧时间对肺小动脉PHD3蛋白表达的影响Fig.12 Immuno－histochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）3protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

讨 论

COPD患者后期由于长期的慢性缺氧，可导致肺小动脉痉挛、收缩以及结构重塑，肺动脉压升高及肺血管阻力增加，右心后负荷加重，最终导致右心室肥厚、肺心病。本实验对大鼠进行缺氧处理，大鼠mPAP于缺氧7d显著升高，同时出现HPVR，随着缺氧时间进一步延长，mPAP继续增高，HPVR加重，并出现RVHI增加。说明缺氧是形成肺动脉高压和肺血管重塑的重要原因，本实验所复制的大鼠模型可作为研究COPD患者HPH发病机制的动物模型。

本室近年研究表明，HIFs在缺氧大鼠和慢性阻塞性肺疾病患者的HPH发病中起着重要作用。而PHDs作为细胞氧感受器，通过羟基化HIFs特定部位的脯氨酸残基使其进行泛素化降解，而在机体氧浓度和HIFs稳定性协调中也发挥着极其重要的作用［14］。

ING4属于生长因子抑制剂家族成员，它具有与PHD家族相类似的锌指结构并参与肿瘤生成、细胞凋亡、DNA修复以及细胞周期控制等一系列过程［9，15］。本试验发现ING4与 PHD2无明显相关性，同前期发现的PHDs调节因子 OS－9不同［12］，研究表明ING4并非PHD2的作用底物也不影响其活性表达，而是两者结合后共同抑制 HIF－1募集p300/CBP从而抑制其转录活性［16］。本试验中ING4蛋白和mRNA水平在缺氧3d和7d后升高，而随缺氧时间延长在21d均有所下降但仍高于对照组，关于ING4的调节机制仍需进一步研究。

根据以上结果推测，大鼠肺动脉高压模型中ING4、PHDs和HIF－1α的表达变化可能是缺氧性肺动脉高压（HPH）发生发展的重要发病机制。

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