短期雌激素替代治疗对中老年卵巢切除大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维影响的体视学研究

罗艳敏 何 琦 吕福林 肖 倩张 蕾 仇 玄 晁凤蕾 唐 勇

（400016 重庆，重庆医科大学：组织学与胚胎学教研室，干细胞与组织工程学研究室）

既往研究报道，人类老年化进程中存在认知功能的下降，而女性在绝经后，由于雌激素水平的降低，认知功能下降的进程往往会加速［1］，且绝经期提前的女性更易提前出现痴呆［2］。Sherwin回顾了大量相关的临床调查研究，结果显示ERT能改善绝经后女性的认知功能［3］。在对灵长类动物及啮齿类动物OVX模型的研究中也证实了ERT能够改善认知行为［4，5］。ERT可以改善绝经后女性的认知功能，这一改变的形态学基础自然成为了研究重点。已有大量研究表明ERT是通过增加大脑皮层和海马内神经元的突触可塑性和树突棘数量改善OVX后恒河猴及大鼠的认知功能的［6－9］。

过去的研究已经证实老年大脑体积的下降主要是由于大脑白质的丢失导致［10］，并且是以白质内细小直径有髓神经纤维的大量丢失为主［11］。影像学与行为学研究表明，这种年龄相关的大脑白质损害与老年的认知功能下降密切相关［12，13］。前述研究已经表明雌激素对认知功能及大脑多处结构有积极影响，那么，雌激素与大脑白质的关系如何呢？有研究表明女性绝经后，雌激素水平下降可能是导致白质体积下降及其他白质病变的重要原因之一［14，15］。运用核磁共振成像（MRI）技术，一些学者发现长期ERT可以减少绝经后女性大脑白质的老年性丢失及高信号灶［16，17］，而另一些学者的研究则表明ERT对绝经后女性大脑白质的老年性改变并没有保护作用，反而会加重 大脑萎缩［18－20］。可 见，ERT 对 绝 经后女性大脑白质体积的影响尚存在争议。有髓神经纤维为大脑白质中的重要组分，但目前国、内外尚未见ERT对绝经后大脑白质内有髓神经纤维作用的研究报道。

因此，为进一步深入研究雌激素替代治疗对大脑白质及白质内有髓神经纤维的作用，本研究采用卵巢切除的中老年雌性大鼠为模型，以模拟女性绝经后低雌激素水平的生理状态［21］，给予雌激素替代治疗，并结合体视学原理及电子显微镜技术研究雌激素替代治疗对卵巢切除后中老年大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维的影响。

材料和方法

1.实验动物

19只中老年（10－12月龄）雌性SD大鼠，体质量（322±11）g，由第三军医大学实验动物中心提供，在重庆医科大学实验动物中心饲养，光照时间为12h/d，室温（22±2）℃。连续六天的阴道涂片提示所有动物都处于不规律的动情周期或持续性的动情间期。

2.卵巢切除术及雌激素替代治疗

大鼠在手术进行前均禁食12h，1%的戊巴比妥钠（0.4ml/100g体重）腹腔麻醉，行背部肋下切口，俯卧位固定于动物手术台，对手术部位备皮，常规消毒，切开皮肤、肌肉，摘除双侧卵巢，逐层缝合伤口。术后给予连续3d右后腿肌注青霉素（8万单位/每只）以预防感染。术后第3w，连续6d观察大鼠阴道涂片，所有大鼠均处于动情间期。取大鼠尾尖血测血清雌激素水平及处死后尸检以再次判断卵巢切除是否完全。术后1m，10只大鼠（OVX＋E组）给予持续1m的17β－estradiol（abcam ab120657）颈背部皮下注射（17β－estradiol溶于无水乙醇，用芝麻油稀释至0.1g/ml，无水乙醇∶芝麻油为1∶149，皮下注射剂量为0.0025ml/g体质量［22］，每天9：00a.m.注射）。其余9只大鼠（OVX＋Veh组）给予持续1m的芝麻油颈背部皮下注射（芝麻油内混有无水乙醇，无水乙醇∶芝麻油为1∶149，剂量为0.0025ml/g体质量，每天9：00a.m.注射）。

3.血清雌激素水平测定

为确保卵巢彻底切除及雌激素替代治疗的有效性，对卵巢切除术后第3w末及雌激素替代治疗后两个阶段所采的血进行血清雌激素水平测定，使用化学发光法测定血清雌激素水平（仪器为UniCel DxI 800Immunoassay System from Beckman Coulter），该检测由重庆医科大学附属第一医院内分泌实验室完成。

4.水迷宫测试

采用DMS22型电脑全自动程控Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）。水迷宫直径为150 cm，高为50cm，A、B、C、D 4个入水点将圆桶等分为4个象限。将有机玻璃制圆柱型平台（直径9.5 cm，高28.5cm）随机放入某一象限的中间。水用墨汁染黑，水温控制在23℃左右，实验时保持周围环境的安静。每组大鼠均用Morris水迷宫进行连续6d的空间学习记忆能力的测试。前5d为隐藏平台实验，水面高于平台1－2cm，每个入水点均要测试1次，入水点顺序随机选择，先把动物置于平台上15s，让其熟悉周围环境，动物入水时面向池壁，轻放入水。记录动物的寻台时间（从入水到找到平台且四肢爬上平台的时间，即潜伏期）。若入水180s仍未找到水池中的平台，可将其置于平台上15s，并且记录寻台时间为180s。若动物爬上平台未停留15s又入水游泳则继续计时，直到其爬上平台停留15s或游泳时间超过180s。一个入水点测试结束，从平台上取下休息60s后再进行下一个入水点的测试。测试环境及平台位置相对不变。第6日为可见平台实验，重新选择一个象限放置平台，平台高出水面1－2cm。仅选择两个远离平台的入水点测试，其他过程同隐藏平台实验。

5.标本固定与取材

水迷宫后，每组大鼠随机选取5只，对大鼠进行1%的戊巴比妥钠（0.4ml/100g体质量）腹腔麻醉，2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液（pH＝7.4）心灌流固定，去除小脑、脑干，将大脑完整取出。

6.白质体积的测量

将左、右大脑半球分别沿冠状线切成l mm的连续等距切片，在每张大脑切片的枕面随机叠加透明的等距测点框，在解剖显微镜下计数所有落在白质上的测点数（图1），根据卡瓦列里原理［23，24］计算出整个大脑白质的总体积V（wm）。

图1 计数落在白质上的点数的方法（解剖显微镜×10）Fig.1 An illustration of the method to count the number of the points hitting the white matter（anatomy microscope，×10）.

7.电镜标本的制作

每只大鼠大脑随机抽取一侧半球，在这些半球中，每隔2张切片抽取1张，第1张切片在前3张中随机确定。在抽取出的大脑组织薄片上随机叠放等距测点框，在测点击中白质的地方抽取白质组织块，保证白质的各个部位都有相同的抽中机率［23］，每个大脑半球抽取5个白质组织块。抽取出的白质组织块用4%戊二醛在4℃条件下浸泡固定2h，用0.1 mol/L PBS（pH＝7.2）冲洗3次，在1%锇酸（Os04）中固定l h。脱水、浸透、醋酸双氧铀染色。先用球切法（isector）［23］包埋组织块以保证各个方向分布的神经纤维都有相同的抽样概率，再用常规电镜包埋法包埋白质组织块。从每个包埋好的组织块上随机切取1张60nm的超薄切片，每张切片上随机选择8个视野放大6000倍照相。

8.白质内有髓神经纤维的体视学定量分析

8.1 有髓神经纤维的长度密度和总长度：在6000倍放大的电镜照片上随机叠加无偏计数框，依据无偏计数框的计数原则（禁线原则）计数有髓神经纤维断面数［25］（图2），按公式［23，24］计算白质内有髓神经纤维的长度密度［Lv（nf/wm）］和白质内有髓神经纤维总长度L（nf，wm）。

8.2 有髓神经纤维的体积密度和总体积：在6000倍放大的电镜照片上随机叠加计数点，计数落在有髓神经纤维上的测点数，以及落在整个照片内的白质的测点数［23］（图3），按公式［23，24］计算白质内有髓神经纤维的体积密度Vv（nf/wm）和白质内有髓神经纤维的总体积V（nf，wm）。

8.3 髓鞘的体积密度和总体积：在6000倍放大的电镜照片上随机叠加计数点，计数落在有髓神经纤维髓鞘上的计数点数以及落在整个照片内的白质上的计数点数［23］（图3），按公式［23，24］计算白质内有髓神经纤维的髓鞘体积密度Vv（ms）和髓鞘的总体积 V（ms，wm）。

图2 计数白质内有髓神经纤维断面的方法（透射电镜×6000）Fig.2 An illustration of the method to count the number of the myelinated fiber profiles in the white matter（Transmission electron microscope，×6，000）.

图3 计数落在白质内有髓神经纤维断面上和髓鞘上测点数的方法（透射电镜×6000）Fig.3 An illustration of the method to count the number of the points hitting the myelinated fibers and myelin sheaths in the white matter（Transmission electron microscope，×6，000）.

8.4有髓神经纤维的平均直径：测量所有被无偏计数框计数的有髓神经纤维断面的直径。首先确定有髓神经纤维断面的最长轴，与该最长轴相垂直的所有横轴中最长的一条为其直径［11］。测量所有被无偏计数框计数的有髓神经纤维断面的直径，并将直径按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μm及1.8μm以上计数不同直径等级下的纤维断面数，然后除以总纤维断面数，得出每一纤维直径等级的纤维在总纤维中所占的比例，再乘以有髓神经纤维总长度，就得出了每一纤维直径等级的纤维长度的分布状况。

9.统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件，经过正态分布检验后对隐藏平台实验的数据进行重复测量数据的方差分析，可见平台实验的数据用非参数检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。将OVX＋E组和OVX＋Veh组大鼠的大脑白质及白质内有髓神经纤维各统计参数经过正态分布检验后用student－t检验进行比较，P＜0.05为差异有显著意义。组内的变异由变异系数CV（coefficient of variation）（CV＝SD/Mean）评估。各大脑间有髓神经纤维总体积及总长度的生物学变异CVbio（biologic coefficient of variation），可通过体视学抽样变异（观察误差系数，observed coefficient of error，OCE）和观察脑间变异系数（observed inter－brain coefficient of variation，OCV），运用公式OCV2＝ CV2bio＋ OCE2［26］得到。OCE可通过每个脑的误差系数（coefficient of error，CE）获得，按公式计 算［27］。由卡瓦列里原理得出的每一个大脑白质体积的CE［V（wm）］可根据 Gundersen et al.（1999）［28］给出的公式计算。由于有髓神经纤维的长度密度、体积密度以及髓鞘的体积密度为比率估计量，它们的CE可按照Kroustrup和Gundersen［26］给出的公式计算。白质内有髓神经纤维总体积和总长度的CE值通过Tang和 Nyengaard［23］给出的公式计算。

结 果

1.雌激素水平测定

卵巢切除术后大鼠血清雌激素水平为（10.60±4.95）pg/ml。给予雌激素替代治疗后，OVX＋E组血清雌激素水平维持在（150.56±25.47）pg/ml，安慰剂治疗的OVX＋Veh组雌激素水平为（18.33±4.39）pg/ml。

2.水迷宫测试结果

前5d的隐藏平台实验中，OVX＋E组大鼠每天的潜伏期明显短于OVX＋Veh组（P＝0.003，图4），而在可见平台实验中，两组大鼠的潜伏期之间没有区别（P＝0.170，图4）。

图4 OVX＋Veh组与OVX＋E组大鼠水迷宫潜伏期的比较Fig.4 Mean escape latencies of OVX＋Veh rats and OVX＋E rats from day 1to 6（Mean±SEM）are shown.a indicats the latencies of OVX＋E rats significantly shorter than those of OVX＋Veh rats（P＜0.05）.

3.体视学结果

大脑白质及白质内有髓神经纤维的体视学统计结果以及CE值的计算结果见表1，白质内有髓神经纤维直径分布图见图5。大鼠大脑白质及有髓神经纤维的体视学研究结果显示，OVX＋Veh组与OVX＋E组大鼠的大脑白质总体积、白质内的有髓神经纤维的长度密度、总长度和体积密度、有髓神经纤维平均直径以及髓鞘的体积密度均无统计学差异（P＞0.05）。主要体视学测量结果的体视学抽样变异小于15%，生物学变异（CVbio）占观察总变异（OCV）的75%左右。

图5 OVX＋veh组大鼠与OVX＋E组大鼠有髓神经纤维平均直径分布的比较Fig.5 Comparisons of the myelinated fiber length with different diameters in the white matter between OVX＋Veh rats and OVX＋E rats.

表1 2组大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维的体视学统计结果Table1 Stereological results of the white matter and the myelinated fibers in the white matter of the two groups

讨 论

有大量的临床研究报道ERT可改善绝经后女性的认知功能［3］，并且这一结论在灵长类动物模型及啮齿类动物模型的研究中也得到了验证［4，5］。本研究中，经过1个月的ERT后，运用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间记忆能力，OVX＋E组的大鼠的空间记忆能力明显优于OVX＋Veh组大鼠，这与既往的一些研究结果是一致的［29，30］。但是包括WHI（Women’s Health Initiative Memory Study）在内的诸多临床调查研究并没有证实ERT对绝经后女性认知功能的积极作用［31］。Sherwin在对既往临床的调查研究回顾中发现，导致ERT对绝经后女性认知功能作用差异的关键原因在于ERT开始的时间不同，绝经后早期阶段就开始ERT的女性认知功能得到了改善，而在绝经后多年才开始ERT的女性则没有表现出认知功能的改善［3］。这种ERT对认知功能作用的时间窗假说在动物模型和临床研究中也得到了证实［32，33］。Sherwin等的综述中总结到雌激素替代治疗对女性认知的保护作用只体现在年轻女性和中老年女性，而在老年女性则可能对认知造成损害，中老年女性ERT的关键时期为50－59岁［32］。Bohacek等的研究提出中老年雌性SD大鼠卵巢切除模型ERT的关键时期为卵巢切除术后5个月内［33］。本实验研究中，ERT开始于OVX术后一个月，在中老年卵巢切除大鼠ERT的关键时期内，Morris水迷宫的实验结果再次证明了ERT对认知功能的改善作用。

由此看来，在绝经后早期或OVX后短期内进行ERT对认知功能有积极的作用。基于大脑白质在大脑认知功能中的重要地位，ERT对大脑白质的作用如何呢？运用核磁共振成像（MRI）技术，Ha等［16］发现长期的ERT可以减少白质的老年性丢失，Liu等［17］报道长期低剂量的ERT可减少绝经后女性大脑白质的高信号灶。但同样运用MRI技术测量大脑白质信号，Low 等［18］和 Greenberg等［19］的研究发现ERT对绝经后女性的大脑白质体积没有显著影响，Luoto等［20］的研究甚至表明ERT不仅不能减少绝经后女性大脑白质病变，反而会加重大脑萎缩。既往关于ERT对大脑白质体积作用的研究均为影像学研究［16－20］，虽然影像学手段可以直接获取活体的整个大脑的白质信息，但是，影像学信息是间接的，且影响因素复杂。在影像学图像上，要清楚地划出白质的边界也不是非常容易。本研究基于现代体视学方法的基本原理，实现了三维空间内的精确定量。本实验研究结果显示，为期1m的ERT对中老年卵巢切除大鼠的大脑白质的体积并没有显著性的影响。这个结果虽然与Low等［18］和Greenberg等［19］的结论相一致，但是本研究结果并不能否认ERT对中老年大脑白质的积极作用。总结过去ERT对大脑白质体积作用的研究，不难发现，导致结论不一的因素除了定量方法的局限外，也可能存在ERT治疗时间窗的影响。在Ha等的研究中受试对象为平均绝经时间25.4年的妇女，接受ERT的持续时间平均为23.1年，可以说，受试对象基本在绝经后短期内即开始了ERT［16］，结论为ERT可以减少大脑白质的老年性丢失。而在Greenberg等［19］和 Luoto［20］等的研究中，受试对象的平均年龄分别为70岁、74.8岁，而她们的绝经年限不详，ERT开始时间的年龄分布较广，且ERT开始时间与绝经期的关系不详，他们得出ERT对绝经后女性大脑白质体积没有影响的结论也是可以接受的。在本实验研究中，ERT开始于OVX术后1m，可以排除雌激素治疗时间窗假说的干扰，得出此结论，有一个关键因素为ERT持续的时间。在Ha等［16］的研究中，ERT持续时间平均为23.1y，相当于寿命的四分之一，而在本实验中，仅为期1m的ERT，因此，并不能否认长期ERT可以保护老年大脑白质。

有髓神经纤维为大脑白质中的主要成分，正常老年大脑白质存在有髓神经纤维的显著性丢失［11］。有髓神经纤维参与神经冲动的跳跃式传导，脱髓鞘改变的神经纤维传导速度下降也许是老年大脑认知功能降低的重要原因之一［34］。本团队早期研究发现，雄性大鼠大脑白质的老年性改变早于雌性，18 m雄性大鼠白质内有髓神经纤维总长度下降的程度远大于雌性［35］。18m 雌性大鼠刚进入老年期［36］，体内雌激素水平还没有显著下降，可能是雌激素对髓鞘的保护作用使18m雌性大鼠白质内有髓神经纤维总长度较年轻大鼠没有显著性下降［35］。Crawford等在对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型研究中发现，给予雌激素受体β的配体替代治疗后，即使在炎症存在的情况下，胼胝体内轴突的结构和功能均得到保护，并且出现髓鞘再生［37］。Patel等的研究发现，双环己酮草酰二腙诱导脱髓鞘的卵巢切除小鼠接受雌激素替代治疗后，可促进其胼胝体内正常的髓鞘形成、减少脱髓鞘，并且可以促进髓鞘再生［38］。因此，我们推测雌激素可能通过防止有髓神经纤维脱髓鞘来保护大脑白质的老年性皱缩。本研究基于体视学原理，结合透射电镜技术，在细胞水平和超微结构水平定量研究ERT对大脑有髓神经纤维的影响。本实验研究结果显示，为期1m的ERT对中老年OVX大鼠的大脑白质内有髓神经纤维的总体积、总长度、平均直径及髓鞘的总体积均没有显著性的影响。但该结论与其他学者研究的结果并不完全矛盾。在本团队的前期研究发现，中老年雌性大鼠（18m）的白质体积较年轻雌性大鼠（6－8m）并没有显著性的丢失，而其白质内有髓神经纤维和髓鞘的体积反而较年轻雌性大鼠明显增加［35］。因此在本研究中，10－12m的中老年大鼠经历一个月的术后休息期和一个月的ERT，大脑白质内有髓神经纤维在仅仅两个月内可能并没有发生显著地老年性改变，导致短期的ERT对大脑白质体积及白质内有髓神经纤维的作用均不显著。

本实验中主要体视学测量结果的体视学抽样变异小于15%，生物学变异（CVbio）占观察总变异（OCV）的75%左右，这说明体视学抽样变异仅占观察总变异的一小部分（表1）。因此，本实验统计学结果表明，本实验设计各阶段抽样的样本量是足够的，不需要再对本设计的抽样方案进行进一步的分析和优化。本实验对中老年卵巢切除大鼠给予一个月ERT，一个月的ERT相对较短，这是本实验的局限性。为明确ERT对中老年大脑白质及白质内有髓神经纤维的影响，下一步需要进一步研究长期ERT对中老年大脑白质及白质内有髓神经纤维的作用。

综上所述，为期1m的ERT可以改善中老年卵巢切除大鼠的空间记忆能力，但是对中老年卵巢切除大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维并没有显著性的影响。本研究运用的方法可为将来运用该模型研究ERT对正常老年大脑白质及神经退行性疾病状态下大脑白质的作用提供可靠、有效的研究手段。

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