电针对脑缺血再灌注大鼠齿状回Nestin、GFAP表达的影响

2014-07-05张业贵李怀斌

中国组织化学与细胞化学杂志 2014年2期

张业贵龚鑫李怀斌

（皖南医学院解剖学教研室，安徽芜湖 241002）

缺血性脑卒中是临床上常见的急性脑血管病，具有高致残率的特点，严重影响了患者的生存质量。传统观点认为，脑缺血致残的原因，与成年哺乳动物脑内神经元缺乏再生能力、损伤后易形成胶质瘢痕有关。因此，近年来，与神经再生有关的神经干细胞，与胶质瘢痕形成有关的反应性星形胶质细胞越来越受到人们的重视，成为神经科学领域研究的热点。针灸在临床上对脑缺血有良好的治疗作用，但其具体作用机制尚不明确，本实验参照Longa等［1］，采用线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，通过动态观察脑缺血再灌注大鼠齿状回巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrilliary acidic protein，GFAP）表达的变化，以及电针对内源性神经干细胞增殖、星形胶质细胞活化状态的影响，探讨电针治疗脑梗死的可能机制。

材料和方法

1.材料、试剂及仪器

成年SD大鼠72只，体重250－300g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008－0033。兔抗nestin、兔抗GFAP（北京博奥森公司）及SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），低频电子脉冲治疗仪（G6805－2，上海医用电子仪器厂），Olympus显微镜及成像系统（日本），Image－J（National Institute of Health，美国）图像分析软件。

2.造模及分组

采用线栓法建立MCAO再灌注模型，用3%戊巴比妥钠（1ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉生效后，将大鼠仰卧固定，去颈部毛，碘伏消毒。沿颈部正中切开皮肤，在右侧肌肉深部分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎并剪断ECA远端。暂时夹闭ICA、CCA，用眼科剪将ECA结扎处近端剪一小口，从此口插入钓鱼线（直径0.26mm，头端烧成圆形），经ICA插至大脑前动脉（ACA），鱼线平均插入深度为18.5±0.5mm至微感阻力。结扎ECA残端以固定鱼线和防止出血，将栓线末端留少许在外。缺血2h后，将栓线拉出至ECA结扎端进行再灌注。造模后大鼠出现患侧Horner综合征，对侧不同程度偏瘫体征，视为模型成功。假手术组仅暴露CCA、ECA、ICA，缝合皮肤即可。将造模成功的大鼠随机分模型组、电针组，每组再分为3、7、14和21d等4个亚组，每个亚组6只大鼠，另设各时间点假手术组各6只。

3.电针方法

取百会和大椎穴，用30号1寸毫针电针，频率2Hz，强度以大鼠头部能轻微抖动为度。持续30 min，每天1次，分别治疗3d、7d、14d、21d。假手术组和模型组给予常规饲养，不做任何处理。

4.行为学观察

各组大鼠在处死前进行神经功能评分，评分标准参照Longa［1］评分法。0分：正常；1分：左侧前肢不能完全伸直；2分：向左侧转圈；3分：行走向左侧倾倒；4分：不能自己行走或昏迷。

5.取材和免疫组织化学染色

用30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪开胸腔暴露心脏，穿刺针经左心室至升主动脉，先快速灌注100ml生理盐水，再用4℃1%多聚甲醛300 ml灌注，30min内完成。断头取脑，于4%多聚甲醛中固定，过夜，常规石蜡包埋。连续切片，片厚5 μm。常规脱蜡至水，微波热抗原修复，一抗nestin、GFAP均选用兔抗人多克隆抗体（北京博奥森公司），稀释度为1∶100，阴性对照实验用PBS代替一抗，余步骤相同，按照SABC（武汉博士德公司）试剂盒说明书进行免疫组化染色，光学显微镜下观察结果。

6.细胞计数及灰度值测定

每亚组选取相同冠状切面的切片各12张（其中每只大鼠选取2张），利用读数显微镜在10×40倍视野下对每张切片DG区域的nestin、GFAP阳性细胞进行计数，使用Image－J图像分析软件检测细胞平均灰度值。

7.统计学处理

使用SPSS 16.0统计软件分析数据，结果以平均值±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.各组大鼠神经功能缺损评分比较

假手术组大鼠在各时间点未见神经功能缺损，评分均为0分（未列数据）；模型组神经功能缺损症状明显，3d时最重，且功能恢复较慢（7d、14d，P＞0.05），而电针组在7d、14d、21d时神经功能缺损症状明显改善，评分和同时间点模型组之间，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分（n＝6，±s）Table1 Table1Neurologic imparment scores in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与同时间点模型组比较（Compared with model group at the same time）；△P＜0.01，与同组3d比较（Compared with the same group of 3day）

组别（Group）3d 7d 14d 21d模型组（Model Group） 3.17±0.75 2.67±0.52 2.50±0.55 2.17±0.75△电针组（EA Group） 2.83±0.41 1.83±0.75＊△ 1.33±0.52＊＊△ 1.17±0.41＊＊△

2.各组大鼠齿状回nestin阳性细胞数及平均灰度值比较

表2、图1示，在正常大鼠齿状回颗粒细胞下区，nestin阳性细胞呈棕黄色，以胞浆着色为主，表达较弱；模型组nestin的阳性细胞数在3d时开始增加，7d时数目最多（P＜0.01），灰度值明显降低（P＜0.01），14d时表达稍有下降，但仍显著高于假手术组（P＜0.05），21d时表达降低；与模型组比较，各时间点电针组阳性细胞数目均显著增加，灰度值降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 各组大鼠齿状回nestin阳性细胞数及平均灰度值（n＝6，±s）Table2 The number of nestin IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与同时间点假手术组比较（Compared with sham operation group at the same time）；△P＜0.05，△△P＜0.01，与同时间点模型组比较（Compared with model group at the same time）

组别（Group）细胞数（个/400倍视野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手术组（Sham operation group of 3day）5.50±4.30 183.49±4.06 3d模型组（model group of 3day） 15.67±5.60＊＊ 179.03±3.50 3d电针组（EA group of 3day） 20.75±6.30＊＊△ 172.41±6.73＊＊△△7d假手术组（Sham operation group of 7day） 5.08±4.01 182.67±3.98 7d模型组（model opertion group of 7day） 21.33±6.51＊＊ 175.04±7.77＊＊7d电针组（EA group of 7day） 29.42±6.56＊＊△△ 155.54±8.68＊＊△△14d假手术组（Sham operation group of 14day） 6.42±4.76 183.62±4.08 14d模型组（model opertion group of 21day） 17.00±6.93＊＊ 177.23±5.85＊14d电针组（EA group of 14day） 22.17±7.17＊＊△ 171.42±5.81＊＊△21d假手术组（Sham operation group of 21day） 5.83±5.01 182.25±5.28 21d模型组（model opertion group of 21day） 8.83±3.35 179.64±6.91 21d电针组（EA group of 21day） 14.33±6.64＊＊△ 174.40±6.12＊＊△

3.各组大鼠齿状回GFAP阳性细胞数及平均灰度值比较

各组大鼠齿状回均有GFAP阳性表达，多呈棕褐色，以胞浆和突起着色为主，假手术组胞体较小，突起较短，模型组和电针组胞体较大，突起较长，染色较深。假手术组GFAP的表达较少；模型组各时间点阳性细胞数较假手术组均明显增加，灰度值降低（P＜0.05或P＜0.01），3d时表达开始增高，14 d达高峰，21d有所下降；与模型组比较，电针组在7d、14d时GFAP的表达强度均明显降低，灰度值增加（P＜0.05或P＜0.01），但阳性细胞数变化不明显（P＞0.05），电针21d时GFAP阳性细胞数及表达强度均显著下降（P＜0.01）（表3、图2）。

表3 各组大鼠齿状回GFAP阳性细胞数及平均灰度值（n＝6，±s）Table3 The number of nestin GFAP IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

组别（Group）细胞数（个/400倍视野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手术组（Sham operation group of 3day）17.25±4.11 184.27±8.92 3d模型组（model group of 3day） 24.08±5.60＊＊ 175.16±6.43＊3d电针组（EA group of 3day） 25.00±5.83＊＊ 177.55±8.49 7d假手术组（Sham operation group of 7day） 16.17±5.31 182.44±7.97 7d模型组（model opertion group of 7day） 28.75±5.82＊＊ 171.11±7.93＊＊7d电针组（EA group of 7day） 27.75±5.01＊＊ 178.99±9.57△14d假手术组（Sham operation group of 14day） 15.33±6.10 180.82±7.51 14d模型组（model opertion group of 14day） 37.25±6.98＊＊ 154.53±8.04＊＊14d电针组（EA group of 14day） 33.58±6.72＊＊ 172.49±12.03＊△△21d假手术组（Sham operation group of 21day） 15.08±5.26 181.95±6.45 21d模型组（model opertion group of 21day） 26.92±6.37＊＊ 169.56±9.97＊＊21d电针组（EA group of 21day） 19.83±6.91△△ 181.90±10.53△△

讨论

Nestin是一种胚胎性中间丝蛋白，在成年中枢神经系统中，表达于多潜能神经前体细胞胞质中，因此nestin已成为鉴定神经干细胞的重要标志蛋白之一［2］。成年鼠海马齿状回颗粒下层存在着神经干细胞，为了保持齿状回颗粒细胞定期死亡后细胞数量的稳定，颗粒下层的神经干细胞会以同样的速度进行增殖［3］。在缺血等病理性损伤时，齿状回神经干细胞也可以增殖、迁移及分化为神经元，参与受损神经元的自我修复，但脑缺血刺激产生的内源性神经干细胞数量不足，而且调节干细胞增殖、迁移、分化以及神经元修复和突触形成的因子也不足［4］，因此，需要介入适当的治疗手段以促进内源性神经干细胞的增殖和分化，加速神经功能的恢复［5］。

Kluska等［6］研究发现，成年大鼠局灶性脑梗死后，能刺激齿状回区的神经再生，本研究结果也显示，脑缺血后齿状回颗粒下区nestin在各时间点的表达均增加，7d时表达最多，但随着时间的延长，nestin阳性细胞逐渐减少，表达强度也逐渐降低，神经缺损症状恢复不明显，结果表明脑缺血可以刺激内源性神经干细胞的增殖，但这种自我调节的能力是有限的，尚不足以持续修复受损神经元。在给予电针治疗后，nestin阳性细胞的数量及表达强度均显著提高，神经缺损评分明显降低，说明电针可以增强脑缺血后内源性神经干细胞的增殖，改善神经功能。有研究发现，脑损伤后神经干细胞可以分化为未成熟神经细胞和星型胶质细胞［7］，因此电针治疗后，可能通过促进神经干细胞的增殖及分化，修复受损神经元，恢复神经功能［8］，这可能是电针对脑缺血产生治疗作用的重要机制之一。

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种神经细胞，广泛分布于脑的各个区域，能维持神经元的正常功能，在神经元的发育、迁移、突触连接的形成中扮演了重要角色［9，10］。近年来研究发现，脑缺血后星形胶质细胞增生活跃，星形胶质细胞的反应性增生可以吞噬坏死组织碎片、充填神经元损伤后产生的空缺，并可以降低谷氨酸等有毒分子对神经元的毒性作用，还能够分泌多种具有神经营养和保护作用的细胞因子等［11］，因而对受损神经元起到代偿和修复作用。但过度增殖的星形胶质细胞，也可能分泌毒性细胞因子等有害物质，加剧神经元的损伤，并且可形成瘢痕，导致轴突的再生障碍［12］。

GFAP是星形胶质细胞的特异性蛋白，其表达量的多少可作为脑损伤后星型胶质细胞活化及增殖的标志［13］。本实验结果显示，脑缺血后7d时齿状回GFAP的表达即明显增加，至14d时阳性细胞表达最强烈，突起变粗，21d时的表达依然较高，显示脑缺血能明显刺激星形胶质细胞的反应性增生，是机体的代偿性保护反应。电针治疗7、14、21d后，GFAP的表达强度明显降低，相同时间点的神经功能评分显著降低，表明电针抑制了星形胶质细胞的过度活化及增殖状态，为神经再生和功能重建提供了更有利的生存环境［14，15］。杨卓欣等［16］研究证实，脑缺血后海马部位星形胶质细胞增生活跃，电针治疗后可明显抑制其过度增殖，并可以促进其分化。

综上所述，本研究结果显示，电针能明显改善脑缺血大鼠的神经功能缺损症状，其作用机制可能与其促进内源性神经干细胞的增殖和神经再生，下调GFAP的持续过度表达，干预星型胶质细胞的活化状态有关。但神经干细胞和星型胶质细胞向神经元发生分化、迁移的分子机制如何，尚需进一步深入研究。

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