HPLC法同时测定红曲中两种构型洛伐他汀的含量

汪 静 杭州市第一人民医院药剂科 杭州 310006

HPLC法同时测定红曲中两种构型洛伐他汀的含量

汪 静 杭州市第一人民医院药剂科 杭州 310006

红曲；洛伐他汀；HPLC

红曲为红曲菌（Monascus）的发酵产物，古代称丹曲，是我国传统中药，李时珍在《本草纲目》谷部中记载：“红曲，甘、温、无毒，主治消食，活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷”[1]。研究表明，红曲中所含有的洛伐他汀（Monacolin K）具有降血脂、降血压、降低胆固醇等作用[2]，其所含有的Monacolin K具有酸型（开环型）和内酯型（闭环型）两种结构形式。研究表明，Monacolin K由内酯型结构转变成酸型结构后，抑制胆固醇生物合成中关键酶的能力大约是内酯性的2倍[3-4]，Monacolin K在人体内通常由内酯型水解成酸型，进而起到较好的降血脂效果。然而，在实际应用中Monacolin K的含量也并非越高越好，应该对其进行适量应用。目前，对红曲中所含有的内酯型Monacolin K含量研究较多，但并不能准确的代表两种构型Monacolin K的含量。因此，本实验建立HPLC同时法，对药材市场上红曲中所含有的两种构型Monacolin K含量进行测定，为红曲的进一步综合开发利用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材 料 红曲购于浙江中医药大学中药饮片厂（20120819）。洛伐他汀标准品（批号100601-200502），购自中国药品生物制品鉴定所）、乙腈（20120311），其它试剂如：甲醇、磷酸等均为分析纯。

1.2 仪 器 METTLER TOLEDO AB204-3电子天平（梅特勒托利多电子天平生产厂）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Agilent1200液相色谱仪（Agilent公司）；色谱柱：ODS-C18柱（250mm×4.6mm×5μm）。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 内酯型对照品溶液的配置 精密称取标准品（Monacolin K）10.65mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度，超声溶解30min，冷却，摇匀。制成0.213mg/mL的对照品储备液。精密吸取对照品储备液5.0mL于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成浓度为42.6ug/mL的对照品溶液，备用。

2.1.2 酸型对照品溶液的配置 精密称取标准品（Monacolin K）10.00mg，置于50mL容量瓶中，加4mL甲醇溶解，然后加20mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液[5-8]，超声30min，冷却，用3mol/L磷酸调节pH至6左右[5]，加甲醇定容，稀释至所需浓度即可。该方法不仅所需时间短，而且洛伐他汀（内酯型Monacolin K）完全转化为酸型Monacolin K，见图1。

2.2 样品溶液的制备 精密称定红曲样品0.30g，置于50mL锥形瓶中，加20mL甲醇提取，超声1h，冷却，抽滤，浓缩、定容至10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度。取样品溶液，离心10min后（3000r/min），用0.45μm微孔滤膜过滤，待测。

2.3 检测条件的选择 通过全波段扫描[9]，得出波长在230nm～254nm下对照品的吸收峰相对较大，对230、238、254nm波长下的对照品进行测定，得出在238nm波长下所测得目标成分峰面积最大，因此，本实验选取238nm作为本实验的检测波长。

实验选取常用流动相乙腈-0.2%磷酸（80:20）为流动相，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，柱温为室温。

2.4 内酯型和酸型Monacolin K的定性测定 取内酯型Monacolin K标准溶液进样测定，进样20μL，所测目标成分在6.582min处有唯一吸收峰，见图1。取处理好的酸型Monacolin K对照品溶液，所测得目标成分在4.465min处有唯一吸收峰，见图2。

图1 酸型Monacolin K对照品的色谱图

图2 内酯型Monacolin K对照品的色谱图

2.5 标准曲线的建立 分别精密移取0.213mg/mL的对照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0和15.0mL，各置于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为8.52、17.04、42.60、85.20和127.80μg/mL的对照品，检测波长为238nm，进样量为20μL。以Monacolin K的含量X为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=65152x+15793，r= 0.9999，表明Monacolin K在8.52-0.17280μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度测定 取“2.1.1”制备的Monacolin K标准溶液，进样20μL，在238nm波长下检测，连续测定5次，所测5次峰面积的RSD=1.45%，精密度实验符合要求（＜3%），表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别测定放置0、30、60、120、180、240min后，分别进样20μL，在238nm波长下检测（以内酯型Monacolin K计算）。所测得6次峰面积的RSD= 1.73%，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率实验 取已知浓度的样品，分别加入高、中、低三种浓度的洛伐他汀标准溶液（以内酯型Monacolin K计算）进行加样回收试验，计算回收率，结果平均回收率为98.81%，RSD为0.27%（n=9），表明方法的准确性良好，方法可行。结果见表1。

表1 Monacolin K加样回收率试验结果（n=9）

2.9 样品中Monacolin K计算及含量测定 内酯型Monacolin K浓度=（内酯样品面积/标品面积）×标样浓度；酸型Monacolin K浓度=（酸样品面积/标品面积）×标样浓度×1.0445；样品中总Mnacolin K%=（内酯型浓度+酸型浓度）/样品浓度×100%；因每一分子酸型Mnacolin K比内酯型Monacolin K多一分子水，故应乘以系数酸型结构分子量与内酯型结构分子量之比1.0445。

取红曲按“2.2”项下方法制备供试样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图（见图3），记录峰面积，结合标准曲线及内酯型和酸型Monacolin K浓度的计算方法，计算样品含量，本实验测得内酯型Monacolin K含量为0.46mg/g，酸型Monacolin K含量为0.19mg/g，本品红曲中内酯型Monacolin K占了两种Monacolin K的70.77%。

图3 红曲样品的HPLC色谱图：1酸型峰；2内酯型峰

3 讨论

酸型结构Monacolin K不稳定，容易脱水形成Monacolin K内酯型结构，不宜作为标准品，本方法用Monacolin K内酯型结构作为标准品，对水解形成的Monacolin K酸结构进行定性和定量，再用它们对样品进行定性和定量分析。酸型Monacolin K的标准样品可以通过内酯型Moancolin K（Lovastatin）的标准品制取。本实验中的HPLC检测条件对Monacolin K的两种形态都有很好的分离效果。酸型Monacolin K的出峰时间约为4.4min，内酯型Monacolin K的出峰时间约为6.5min。

干燥的固体红曲样品可以近似认为没有水分存在。而Monacolin K在甲醇中的离解常数非常小，远小于在水中的离解常数。因而用甲醇萃取时基本上不存在Monacolin K两种形态发生互变的情况，所以能真实反映原样品中Monacolin K两种形态的比例。能很好的杜绝一些厂家将洛伐他汀参入红曲中的不良行为，适用于保健食品红曲的分析。

随着Monacolin K检测方法的改进，桔霉素检测方法的建立，红曲产品质量的不断提高，功能性红曲作为保健食品和药品的一个新领域，将会为人类的健康事业做出更大的贡献。

［1］李钟庆，郭芳.红曲菌的形态与分类学［M］.北京：中国轻工业出版社，2003：20-23.

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2013-09-23