婴幼儿配方乳粉中非目标性致病菌的分离与系统鉴定*

李 妍，王孝研，胡友波

（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150050）

婴幼儿配方乳粉的生产工艺较为复杂，杀菌、浓缩工序、包装等过程中都容易出现质量问题。杀菌不彻底造成菌落总数过高[1]，导致最终产品微生物超标[2]；设备清洗不彻底、设备故障等，均容易导致产品大肠菌群和杂质超标[3]。并且婴幼儿配方奶粉中营养成分丰富，极其利于微生物的生长繁殖。一旦出现上述质量问题，将对婴幼儿的生长发育及身心健康造成不利影响。而大多数情况下，安全监管者在婴幼儿配方乳粉的生物安全监测方面处于相对被动的局面。通过系统地对婴幼儿配方乳粉中的微生物进行富集培养，菌种分离，菌种鉴定，再对菌种鉴定结果进行分析统计，可全面了解婴幼儿配方乳粉中的菌落分布与构成，对婴幼儿配方乳粉的质量监督与监测和企业的自行监督具有指导意义，并为检测标准的制定提供有力的参考，更为改变监管的被动局面提供充分的理论依据[4]。

对婴幼儿配方乳粉中微生物分离与鉴定方面的研究，在国内、外很少有相关报道。目前，除了国家标准中规定的微生物检验方法外，在1994年，我国仅有关于“奶粉细菌污染情况”的相关报道，但仅限定在菌落总数、大肠菌群、肠球菌和蜡样芽孢杆菌五种微生物指标范围内，并没有对样品中的微生物进行全面的筛查。而且，经过十多年的发展，婴幼儿配方乳粉在生产工艺和其他方面上发生很大改变，其研究结果早已不适用于今日。可见，在婴幼儿配方乳粉中微生物污染情况的调查及研究方面，目前尚存在空缺。

1 实验部分

1.1 实验材料

选取黑龙江省市售的不同品牌、不同批次、不同段数的婴幼儿配方乳粉400个批次进行筛查。

1.2 实验试剂

BPW缓冲蛋白胨水、mLST改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、万古霉素、阪崎显色培养基、TTB四硫磺酸盐煌绿增菌液基础、碘液、煌绿、SC亚硒酸盐胱氨酸增菌液、BS亚硫酸铋琼脂、沙门氏菌显色培养基、Baird-Parker培养基基础、亚碲酸钾卵黄增菌液、血琼脂基础、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，以上培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司；新鲜兔血浆（哈尔滨市疾控中心）；

3M金黄色葡萄球菌测定纸片（美国3M公司）。

1.3 实验设备

VITEK 2 compactsystem全自动微生物鉴定及药敏分析系统（以下简称“VITEK 2 compact”）（美国BIOMERIEUX.inc）；BSC-1000-Ⅱ-A2BSC生物安全柜（北京世安科林净化技术有限公司）；CJ-S-I层流洁净工作台（上海博泰实验设备有限公司）；BagMixer400W拍击式均质器（法国interscience）；MLS-3780高压蒸汽灭菌器（日本三洋）；101-1A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；HZQ-FX全温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；DH-6000BⅡ（3台）电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DW-HL100低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司）。

1.4 实验步骤

1.4.1 样品的处理 取25g婴幼儿配方乳粉（婴儿配方乳粉、较大婴儿和幼儿配方乳粉），分别加入225mLBPW中，使用拍击式均质器均质2min，于36℃培养8～18h。移取1mL前增菌液，转种于10mLTTB，于42℃培养24h；同时，另取1mL增菌液，转种于10mLSC中，于36℃培养24h。分别取1环增菌液，划线于BS和沙门显色培养基上，于36℃培养48h和24h[5]。

另称取25g样品加入225mL灭菌生理盐水中，使用拍击式均质器均质2min。分别取10-1g、10-2g、10-3g各1mL涂布到3个Baird-Parker上，每个平板分别涂布0.3、0.3和0.4mL。同时接种1mL于3M金黄色葡萄球菌测定纸片，于36℃培养48h[6]。

另称取100g样品加入900mLBPW中，使用拍击式均质器均质2min，于36℃培养18h。移取1mL前增菌液，转种于10mLmLST-Vm，于44℃培养24h。取1环增菌液，划线于阪崎显色培养基上，于36℃培养24h。挑去可疑菌落接种于TSI，25℃培养48h[7]。

1.4.2 目标菌的选择 筛选出在选择培养基或试纸片上有阳性反应的菌落，作为可疑菌落，作进一步生化分析。

表1 目标菌株的阳性选择Tab.1 Positive selection of target strains

1.4.3 生化鉴定 将可疑菌落三区划线接种于营养琼脂平板上，36℃培养20～24h，进行纯化。

纯化后的可疑菌落转种于营养肉汤中，36℃振荡培养24h，以保存和后期使用。

使用VITEK 2 compact对纯化后的可疑菌落进行生化鉴定。

2 结果与讨论

2.1 可疑菌落的鉴定结果

表2中为本次试验生化鉴定出的可疑菌株及其获得途径。

由表2中可以看出，在400个婴幼儿配方乳粉的5200个项目中，29个项目共通过18个途径鉴定出15种非目标性致病菌。另外，通过两种不同沙门氏菌检测途径鉴定出2个阪崎肠杆菌。

在鉴定出的非目标性致病菌中，检测金黄色葡萄球菌的途径鉴定出3株；检测阪崎肠杆菌的途径鉴定出11株；检测沙门氏菌的途径鉴定出17株。可见，鉴定中沙门氏菌途径检测出的非目标性致病菌最多。分析其原因，沙门氏菌共有2000多个血清型，换而言之，就是沙门氏菌的均属最多，选择性增菌液及选择性培养基的为了不漏查，往往选择性较差，因此出现假阳性的几率显著增加。

表2 生化鉴定菌株Tab.2 Strains of biochemical identification

2.2 结果与讨论

2.2.1 实验条件的选择

（1）增菌液的选择 试验中增菌液的选择很重要，要选择增菌效果好且合适的增菌液，如若不然会产生假阴性结果。为检测工作带来不必要的麻烦。在本实验中，选择了GB4789.4-2010、GB4789.10-2010和GB4789.40-2010标准中要求的前增菌液和选择性增菌液。所能鉴定的菌株可以从一定层面上证明检测该非目标性致病菌可以选用该途径的增菌液。为相关部门制定检测方法提供了一定依据。

（2）选择性培养基的选择 试验中选择性培养基的选择同样重要，试验中要选择对目标菌有选择专一性且目标菌在上面长势良好的培养基，如若不然，检测工作会更加繁琐。在本实验中，选择了GB4789.4-2010、GB4789.10-2010和GB4789.40-2010标准中要求的选择性培养基。所能鉴定的菌株可以从一定层面上证明检测该非目标性致病菌可以选用该途径的选择性培养基。为相关部门制定检测方法提供了一定依据。

（3）培养分离 在目标菌培养分离过程中，一定会有非目标菌种的存在，注意要将每一种近似目标菌形态的菌落进行培养分离，然后生化鉴定，最后比对与目标菌的区别。这样将会为婴幼儿配方奶粉在生产工艺的改进与微生物污染的控制方面提供依据。

2.2.2 生化鉴定出的非目标性致病菌产生的必然性和可能性分析 婴幼儿配方乳粉在生产或包装过程中，有环境或灭菌不完全会引入一些致病菌，而致病菌的种类不仅仅局限于国家标准上要求的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌3种，而另有15种致病菌作为潜在的危机，仍然没有受到重视。以湿法生产婴幼儿配方乳粉为例，从生产工艺、原料乳等方面分析生化鉴定出的非目标致病菌产生的必然性和可能性。

（1）原料乳验收时需依据GB 19301对原料乳进行检验。原料乳在运输过程中会因为储存条件不当而引起菌落总数超标。有些致病菌在此过程中被引入到原料乳中，如果后期生产时没有得到有效的处理，就会使成品婴幼儿配方乳粉中仍然存在检出致病菌的风险。

（2）净乳过程中，储存在奶缸内的生奶经奶泵打入离心式净乳机进行净乳，去除部分细菌和杂质。如果净乳过程除菌不完全，也会存在成品婴幼儿配方乳粉中检出致病菌的风险。

（3）冷藏前的杀菌为巴氏杀菌。杀菌设备对均质后的原料乳杀菌，浓缩前的杀菌依据不同产品的工艺要求选择合适的杀菌方法。如果灭菌温度、时间不能达到要求就有可能造成杀菌不完全而引起成品婴幼儿配方乳粉中被检出致病菌。

（4）筛粉、晾粉或经过流化床过程，目的是为了降温和让喷雾干燥后的乳粉流动性更好。要控制好灌装车间的温度、湿度及微生物指标和各种接触器皿的无菌清洁。要求灌装车间应达到一定的洁净度等级，以满足此生产过程的环境要求。如果灌装车间不能达到要求的洁净度等级，就会造成暴露在环境中的半成品被污染而引发成品被检出致病菌的可能。

（5）包装过程对包装车间的空气洁净度等级有一定的要求。如果灌装车间不能达到要求的洁净度等级，就会造成暴露在环境中的半成品被污染而引发成品被检出致病菌的可能。

（6）CIP清洗过程要在每一次生产前、后都要对与物料接触的所有设备、管道进行清洗，以保证设备、管道足够洁净而不会造成半成品污染。如果CIP清洗不完全或次数不足就会引起半成品在设备、管道受到污染，而引发成品被检出致病菌的可能。

2.2.3 全自动生化分析系统的优势与不足

（1）与传统方法相比较，利用全自动生化分析系统鉴定待测菌株具有节约时间、鉴定广泛等特点。

（2）但全自动生化分析系统还具有一定的局限性：只能鉴定库中存在的菌株，其他菌株还有待继续升级；选取样品量要求3～4个菌落，如果纯化不完全会造成混杂而鉴定不出来或置信度极低，而造成漏检。因此，要求仪器操作人员具有一定预判能力，以防影响检测结果。

（3）本文只对非目标性致病菌进行分离鉴定，还需要进一步的了解和分析，有待以后工作中继续进行此方向的研究。

由实验结果可以看出，通过沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌3种致病菌的前增菌、增菌和分离培养，分离出一系列的疑似目标菌但并非目标菌的菌落。利用全自动生化分析系统的鉴定纯化后菌落，发现共有肺炎克雷伯菌、鲍曼复合群不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌群、弗劳地柠檬酸杆菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、阴沟肠杆菌、泛菌属、非脱羧勒克菌、浅黄假单胞菌、大肠埃希氏菌、液化沙雷菌、聚团泛菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、人葡萄球菌（人亚种）、克氏库克菌15种非目标致病菌。经生化鉴定，鉴定置信度都在可接受范围内。

3 结论

以黑龙江市售的400个婴幼儿配方乳粉作为研究对象，分离并鉴定出有沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌试验中定为可疑菌株但并非其3种致病菌的其他菌株，并利用全自动分析系统鉴定出婴幼儿配方粉中非目标性致病菌。

依据 GB10765-2010[8]和 GB10767-2010[9]两项婴幼儿食品的国家标准规定的取样原则，要求每个样品做5组沙门氏菌、3组阪崎肠杆菌、5组金黄色葡萄球菌的检测。由此可知，每个婴幼儿配方乳粉样品都要做3类13项致病菌的检测。因此，400个样品共计5200个项目中，共涉及27个样品被鉴定出15种非目标性致病菌。

由此可见，在婴幼儿配方乳粉中仍然存在一定的食品安全隐患，这些非目标性致病菌可能来自生产环节中每一个环节。这就要求婴幼儿配方乳粉生产企业要加强对生产条件和生产环境的优化和管理，以确保婴幼儿配方乳粉不被环境中的致病污染而引起食源性疾病。

通过对这些菌株的生理生化研究将对婴幼儿配方奶粉在生产工艺的改进与微生物污染的控制方面有重要的意义。

[1] 菌落总数检测技术研究进展[J].粮食与油脂，2010，（4）:42-44.

[2] 魏国美.国内食品菌落总数测定方法研究[J].福建分析测试，2008,17（4）:32-35.

[3] 马冬，等.PCR检测乳品中大肠杆菌的研究[J].食品科学，2009,30（4）:260-263.

[4] 魏民,周敏,朱叶秋,等.乡间布丘菌致败血症一例[J].中华检验医学杂志，1999,（2）:45-47.

[5] GB 4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[S].中华人民共和国卫生部.

[6] GB 4789.10-2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].中华人民共和国卫生部.

[7] GB 4789.40-2010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验[S].中华人民共和国卫生部.

[8] GB 10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品[S].中华人民共和国卫生部.

[9] GB 10767-2010食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品[S].中华人民共和国卫生部.