肺腺癌血清肿瘤标志物的筛选与鉴定

杨继要，刘国红，刘德义，丁 一，王 静

（1.郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河南郑州450001；2.郑州大学第一附属医院呼吸科，河南郑州450052）

肺腺癌血清肿瘤标志物的筛选与鉴定

杨继要1，刘国红1，刘德义2，丁 一1，王 静2

（1.郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河南郑州450001；2.郑州大学第一附属医院呼吸科，河南郑州450052）

目的应用蛋白质组学方法筛选肺腺癌患者血清中的肿瘤标志物。方法收集8例肺腺癌患者及8例正常人血清，剔除血清中白蛋白干扰后，得到血清可溶性总蛋白并采用双向电泳方法分离，获得血清蛋白质的双向电泳图谱，经PDQuest7.1凝胶图像软件分析找出表达差异的蛋白点，经基质辅助电离解析飞行时间质谱检测获得待测蛋白的肽质量指纹图谱，通过搜寻蛋白质数据库鉴定出肺腺癌血清中候选的肿瘤相关蛋白。结果建立了肺腺癌患者及正常人血清蛋白质表达谱。经软件匹配分析，共筛选出24个差异的蛋白点，从中选出差异显著的7个蛋白点进行质谱分析，经数据库查询分析，成功的鉴定出5种蛋白质：凝聚素、触珠蛋白、血清淀粉样蛋白A、血清白蛋白A链、纤维胶凝蛋白3。结论本研究建立了人肺腺癌患者及正常人血清的双向电泳图谱；鉴定出了若干肺癌相关蛋白质，为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础。

肺腺癌；血清；双向凝胶电泳；基质辅助电离解析飞行时间质谱；蛋白质组

肺癌严重危害人类健康，早期诊断是提高肺癌生存率的关键［1］，对改善肺癌预后及生存状况具有重要意义。从肺癌血清中寻找与疾病发生、发展过程相关的敏感蛋白质分子，用于作为肺癌诊断及预后评估的血清标志物，将是提高肺癌早期诊断率的有效途径。蛋白质组学研究方法为该途径提供了有力的技术支持［2］。本实验应用蛋白质组学方法，成功构建了分辨率高、重复性好的肺腺癌患者及正常血清双向凝胶电泳的蛋白质图谱，并鉴定出其中存在差异的蛋白质，为寻找肺癌特异性的诊断指标提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料入组8例肺腺癌患者及8例正常人血清均取自2006年至2009年郑州大学第一附属医院肺癌患者，均经过病理学鉴定为肺腺癌。IPG预制干胶条（pH3～10 17 cm）、两性电解质（Bio-lyte Ampholyte 3～10）、矿物油购自美国Bio-Rad公司，四甲基乙二胺、碘乙酰胺、Tris-Base、二硫苏糖醇、CHAPS购自美国Sigma公司，双向电泳系统、Gs-800图像获取仪、PDQuest 7.1凝胶图像分析软件均为美国Bio-Rad公司产品。SwellGel®Blue白蛋白去除试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 血清白蛋白去除按照试剂盒说明进行操作，采用Bradford法测定血清总蛋白浓度，分装后-80℃冻存，用于双向电泳分析。

1.3 固相17 cm pH（3～10）胶条的双向凝胶电泳及图谱分析第1向等电聚焦电泳程序条件设定如下：50 V主动水化16 h；250 V除盐1 h；1 000 V除盐1 h，当升压至10 000 V后再继续聚焦直至60 000 V完成聚焦程序；第2向聚丙烯酰胺凝胶电泳条件如下：分离电流（30 mA/gel/17 cm）。Gs-800扫描获取图像后PDQuest7.1软件进行分析。

1.4 胶内酶解及MALDI-TOF-MS鉴定将扫描分析后的凝胶置于亮光下，用硅烷化的枪头挖取差异蛋白点，将获取的样品交由上海基康生物技术有限公司以协助完成基质辅助电离解析飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）蛋白鉴定，得到各个检测样品的肽质量指纹图谱。

1.5 数据库检索根据肽质量指纹图谱中各肽段的m/z数据，在蛋白质组的相关网站（http：//www.matrixscience.com），利用Mascot查询软件，设置出适当的搜索参数，在蛋白数据库中搜索与酶解肽段相匹配的蛋白，根据搜索结果并结合蛋白质在凝胶上的实际等电点和相对分子质量信息最终确定蛋白质性质。

2 结果

2.1 肺腺癌患者血清和正常人血清的双向电泳图谱的建立经过多次双向电泳，获得重复性较好的肺腺癌及正常血清双向凝胶电泳的蛋白质图谱（图1），平均蛋白点个数为295±15、301±12。可见大部分蛋白质点分布的范围在相对分子质量为31 000～56 000、等电点在5.0～8.0之间，同时可见血清中一些高丰度蛋白在胶面上连接成片。

图1 肺腺癌患者（A）和正常人（B）血清双向凝胶电泳图谱

2.2 肺腺癌患者血清和正常人血清的双向电泳图谱中差异蛋白质点分析对肺腺癌血清和正常血清的双向电泳图谱分别进行匹配分析后，共筛查出24个存在差异的蛋白点，其中Spot 1～8在肺腺癌血清中高表达，而Spot 9～12号仅出现在肺腺癌患者的血清中；Spot 13～22号蛋白点在肺腺癌患者血清中低表达，Spot 23，24号蛋白点仅出现在正常人的血清中。部分蛋白质点的放大图谱见图2。

2.3 差异蛋白点的MALDI-TOF-MS肽质量指纹图及蛋白质鉴定结果从分析出来的24个差异蛋白中选出表达差异较大的7个蛋白点，其中4个蛋白点（Spot 2，3，8，9）在肺腺癌血清中高表达，3个蛋白点（Spot 16，17，19）在肺腺癌血清中低表达，经MALDITOF-MS鉴定后，均获得相应的肽质量指纹图谱（图3）。将其中有代表性的特征数据在蛋白数据库应用Mascot软件搜索并分析，最终5个（Spot 2，3，9，17，19）在数据库中找到匹配的蛋白质（Score＞64，P＜0.05），分别是在肺腺癌血清中高表达的凝聚素、触珠蛋白、血清淀粉样蛋白A和肺腺癌血清中低表达的血清白蛋白A链、纤维胶凝蛋白3。

图2 肺腺癌患者（A）和正常人（B）血清部分蛋白质点放大图谱

图3 Spot 9蛋白点的肽质量指纹图

3 讨论

血清蛋白质样品的制备与细胞、组织样品的制备稍有不同，血清样品成分十分复杂［3］，除了含有大量的蛋白质外，还含有较多的小分子物质，如盐类、氨基酸、脂类和糖类等。如果不加以剔除，将严重影响对大多数的低丰度蛋白的检测。本实验采用 SwellGel®Blue白蛋白去除试剂盒过滤血清，去除了大部分混杂的白蛋白，因此建立了肺腺癌患者血清和正常人血清的双向电泳图谱的表达图谱，并筛查出24个差异的蛋白点，从中选出7个蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定，最终5个蛋白点得到满意的匹配结果，其中凝聚素、触珠蛋白、血清淀粉样蛋白A在肺腺癌血清中高表达，而纤维胶凝蛋白3和血清白蛋白A链则低表达。

凝聚素的是一种黏附蛋白，调节细胞与细胞的相互作用，参与脂类转运，在人体的许多组织中均有表达，有研究［4］表明其在肿瘤组织中的表达高于癌旁组织。

触珠蛋白的主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，被单核细胞以及巨噬细胞表面的血红蛋白受体（CD163）所识别并被吞噬降解，从而除去血循环游离的血红蛋白。触珠蛋白也可能是一种急性期的时相反应蛋白，当机体处于肿瘤、心肌梗塞等一些病理状态时候，血液内的结合珠蛋白含量明显增多［5］。

另本研究结果提示血清淀粉样蛋白A仅在肺腺癌血清中表达。血清淀粉样蛋白是一组多形性蛋白，由104个氨基酸组成，相对分子质量为 12 000～14 000［6］，主要由肝细胞合成并分泌至血。血清淀粉样蛋白A是一种急性时相蛋白，正常情况下血清中含量很低仅为1～5 μg·mL-1，但在炎症、外伤、肿瘤等刺激下，由于单核-巨噬细胞和内皮细胞合成并释放大量的炎性细胞因子，因此诱导肝细胞产生大量的急性期蛋白血清淀粉样蛋白A，其含量可超过正常值的1 000倍［7］。Milan等［8］的研究发现血清淀粉样蛋白在肺癌患者的血清中高表达。本研究也发现血清淀粉样蛋白A肺腺癌患者的血清中高表达。

纤维胶凝蛋白3是激活补体系统的一种识别分子，对维持机体正常免疫功能起重要作用，因此在正常人的血清中含量较高［9］。本研究结果显示纤维胶凝蛋白3在肺腺癌血清中的含量下调，提示在肺癌发展过程中，可能伴随着免疫功能的逐渐减弱。

由于血清标本比组织标本容易获得，所以从血清中筛选出的肿瘤标志物指标更合适应用于诊断和判断预后。本次研究结果中高表达的血清淀粉样蛋白A、凝聚素和触珠蛋白和低表达的纤维胶凝蛋白3，有可能成为有价值的肺癌诊断标志物。

参考文献：

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［3］ P Ahmed N，Barker G，Oliva K，et al.An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum［J］.roteomics，2003，3（10）：1980-1987.

［4］ Hassan MK，Watari H，Han Y，et al.Clusterin is a potential molecular predictor for ovarian cancer patient's survival：targeting clusterin improves response to paclitaxel［J］.J FxpC linC ancer Res，2011，30：113.

［5］ Mendonɕa VR，Luz NF，Santos NJ，et al.Association between the haptoglobin and heme oxygenase 1 genetic profiles and soluble CD163 in susceptibility to and severity of human malaria［J］.Infect Immun，2012，80（4）：1445-1454.

［6］ Malle F，Steinmetz A，Raynes JG.Serum amyloid A（SAA）：an acute phase protein and apolipoprotein［J］.Atherosclerosis，1993，102（2）：131-146.

［7］ Moshkovskii SA.Why do cancer cells produce serum amyloid A acute-phase protein？［J］.Biochemistry（Mosc），2012，77（4）：339 -341.

［8］ Milan F，Lazzari C，Anand S，et al.SAA1 is over-expressed in plasma of non small cell lung cancer patients with poor outcome after treatment with epidermal growth factor receptor tyrosine-kinase inhibitors［J］.J Proteomics，2012，76 Spec No.：91-101.

［9］ Füst G，Munthe-Fog L，Illes Z，et al.Low ficolin-3 levels in early follow-up serum samples are associated with the severity and unfavorable outcome of acute ischemic stroke［J］.J Neuroinflammation，2011，8：185.

Screening and Identification of Serum Tumor Markers in Lung Adenocarcinoma

Yang Jiyao1，Liu Guohong1，Liu Deyi2，Ding Yi1，Wang Jing2
（1.Department of Histology and Embryology，College of Basic Medicine，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；2.Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo screen the tumor markers in serum of patients with lung adenocarcinoma by proteome method.MethodsSerum samples were obtained from 8 patients lung adenocarcinoma and 8 healthy donors.After getting rid of various serum albumin，all the soluable proteins in serum were separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，then the differentially expressed proteins were identified by using PDQuest software analysis.Peptide mass fingerprint maps were obtained by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry and protein identification was performed by searching protein database.ResultsPerfect reproducible two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis image were successfully obtained.Twenty-four differentially expressed proteins were found in serum between patients with lung adenocarcinoma and healthy donors.Peptide mass fingerprinting maps of 7 proteins were obtained and 5 proteins were identified eventually，including clusterin，haptoglobin 2-alpha，amyloid related serum protein，serum albumin chain A，ficolin-3.ConclusionThe two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis maps of serum from patients with lung adenocarcinoma and healthy donor were constructed，several proteins identified in this research may be the potential serum biomarkers for lung cancer.

lung adenocarcinoma；serum；two-dimensional gel electrophoresis；matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry；proteome

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.05.002

R734.2；R730.43

A

1673-5412（2014）05-0374-04

2014-03-05）

河南省医学科技攻关计划项目（编号：200903005）

杨继要（1971-），女，博士，副教授，主要从事肿瘤分子生物学研究。F-mail：yangjiyao123@163.com

王静（1958-），女，博士，教授，主要从事呼吸系统疾病的基础研究和临床治疗工作。F-mail：wangjing@zzu.edu.cn