脑出血大鼠血肿周围脑组织GRP78及GADD153动态表达及神经功能缺损*

涂鄂文 刘秋庭 谭 莉

(湖南省脑科医院神经内科，湖南 长沙 410007)

本研究从ERS的角度研究ERS经典标志物GRP78和GADD153在脑出血大鼠表达的变化，以明确ERS在脑出血后继发的神经损伤的病理生理过程中的意义。为通过干预内质网应激治疗脑出血提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 将正常成年SD大鼠50只(健康3个月龄体质量250±15g清洁级)随机分为2组：假手术组(A组)、脑出血组(B组)。

1.2方法 正常成年SD大鼠，参照Xue方法[1]，制备脑出血模型。假手术组以同样方法注入灭菌生理盐水50 μl。术后根据Longa法[2]进行神经功能缺损评分，无神经功能缺损症状、意识丧失、死亡大鼠被剔除。

各组分别在术前和术后各相应时间点(24小时、48小时、72小时，5天，7天)按Garcia等方法[3]进行神经功能评分。

将各时间点大鼠予以急性断头取脑，用无菌生理盐水冲去多余血液，沿冠状缝及矢状缝去除顶骨及顶间骨，充分暴露大鼠脑组织，取出整个大脑，切取血肿周围5 mm以内脑组织，置于液氮罐中保存，待标本收集齐后再分别予以匀浆，加入样本总体积5～10倍的组织裂解液，冰上裂解30 min；4℃，12000 r/min离心15 min(提前开离心机预冷)；将离心后的上清液小心吸取转移至另一离心管中，标记好动物编号、蛋白性质及提取时间。提取的蛋白在未变性之前冻存于-80℃冰箱保存。

Western-Blot检测：采用胞核-胞浆蛋白裂解液裂解蛋白，BAC法蛋白定量。上样后SDS-PAGE凝胶电泳；湿转法转PVDF膜；一抗(1∶200)4℃孵育过夜后二抗孵育，ECL试剂发光显影成像；光片于凝胶成像系统下白光扫描，进行吸光度分析，用同一标本内参进行校正，并按公式相对值=目的条带表达强度/tubulin表达强度计算出相对值。

2 结 果

2.1神经功能缺损评分 脑出血后大鼠出现神经功能缺损症状，逐渐加重，在48 h达高峰,之后开始逐渐恢复，第7天基本恢复正常，见表1。

2.2脑出血后不同时期大鼠脑组织GRP78的蛋白表达变化 脑出血后GRP78表达增加，呈现先升高后降低的趋势，72小时达高峰，除7天以外的各时间点B组和A组相比较，均具有统计学差异(P<0.05)，见表2，图1。

2.3脑出血后不同时期大鼠脑组织GADD153的蛋白表达变化 脑出血后GADD153表达增加，呈现先升高后降低的趋势，72小时达高峰，两组各时间点比较差异具有统计学差异(P<0.05)。见表3、图2。

表1 实验性脑出血后大鼠神经功能评分表

注：#与A组相比，P<0.05。

表2 脑出血后不同时期大鼠脑组织GRP78和GADD153的平均OD值

注：#与A组相比，P<0.05。

图1 大鼠脑组织GRP78的蛋白表达

图2 大鼠脑组织GADD153的蛋白表达

3 讨 论

细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种细胞死亡形式,受特定基因经特定信号传导途径调控，是机体在生长、发育和受到外来刺激时, 清除衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制。Matsushita等利用胶原酶诱导大鼠脑出血模型发现, 出血中心及其周围可检测到大量凋亡细胞[4]。Qureshi等则在脑出血患者血肿周围组织标本中观察到细胞凋亡，并且细胞凋亡是血肿周围组织细胞死亡的主要形式，在脑出血后继发性脑损害中起重要作用。

细胞凋亡的机制主要为以下几条通路：死亡受体介导，线粒体介导，内质网介导，粒酶介导，Anoiki介导。内质网应激介导的细胞凋亡是一种不同于经典凋亡途径的新的细胞凋亡途径。内质网是一种重要的细胞器，对膜蛋白和分泌性蛋白的合成、翻译后修饰、折叠组装、转运等起重要作用[5]。内质网对稳态改变十分敏感，许多生化和生理刺激都可以扰乱内质网稳态，导致内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白沉积，引起内质网应激。GRP78和GADD153是内质网应激的2个经典标志物，GRP78是内质网伴侣蛋白，是内质网稳态的中心调节剂。未折叠蛋白反应(UPR)可使GRP78大量表达，并与内质网中错误折叠和未折叠的蛋白结合，恢复蛋白质的正确构象，维持内环境稳定，在应激条件下对细胞起保护作用。GADD153 是联系内质网应激与细胞凋亡的重要信号分子，是内质网相关促凋亡蛋白，可被内质网应激诱导表达并通过调节下游基因的表达而促进凋亡。GADD153 基因敲除可增强细胞抵抗内质网应激所致凋亡的能力，相反，GADD153 过表达则使细胞对内质网应激所致的凋亡更敏感。本实验证明，脑出血发生后，脑组织中GRP78显著增加，之后持续增高，72h其表达达高峰，随后开始逐渐下降，持续到第7天仍有较高表达，其表达变化规律与脑出血后神经功能评分变化规律相似。脑出血后，脑组织产生类似于脑缺血的缺血半暗带，组织细胞缺血缺氧，能量衰竭，引起内质网应激，继而引起未折叠蛋白反应可使GRP78 大量表达，协助蛋白质恢复正确构象，维持内环境稳定，从而在应激状态下产生对细胞保护作用。脑组织中GADD153亦有显著增加，提示脑出血后GADDl53表达增加，随着时间的延长，大鼠神经功能缺损逐渐恢复，GADDl53也呈现先增高后降低的变化规律，与GRP78的变化也相符，说明二者参与了脑出血后的内质网应激。

综上所述，GRP78和GADD153可能通过内质网应激介导的细胞凋亡参与脑出血后神经功能损伤的病理生理过程。为脑出血的治疗提供新靶点，为进一步了解脑出血的病理生理机制提供新的研究方向。

[1] Xue M, Del Bigio MR. Intracerebral injection of aulogous whole blood in rats: time course of inflammation and cell death[J]. Neuroscience Letters, 2000, 283(3): 230-232.

[2] Hua Y, Schallert T, Keep RF,et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat [J].Stroke,2002,33(10):2478-2484.

[3] Garcia JH，Wagner S，Liu KF，et al.Neurological deficit and extent of Neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in Rats statistical validation[J].Stroke，1995,26(4):627-635.

[4] Matsushita K, Meng W, Wang X,et al. Eviidence for apoptosis after intercerebral hemorrhage in rat striatum[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2000,20(2):396-404.

[5] Lu N, Li C, Cheng Y,et al.Protective effects of progesterone against high intraocular pressure-induced retinal ischemia re-perfusion in rats[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2008,28(11):2026-2029.