Nav1.7在福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型背根神经节中表达的研究

王 波，邵先舫*，刘志军，陈绍军，李 前，贺渊哲，钟 佳

（1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 415000）

Nav1.7在福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型背根神经节中表达的研究

王 波1，邵先舫2*，刘志军2，陈绍军2，李 前2，贺渊哲1，钟 佳2

（1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 415000）

目的 观察电压门控钠离子通道1.7（Nav1.7）在福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型背根神经节中的表达。方法 SD大鼠24只，随机分为2组，空白对照组（n=12）及福尔马林模型组（n=12）。空白对照组左后足底注射0.1 mL生理盐水，模型组于左后足底注射5%福尔马林0.1 mL，各组大鼠在指定时间点取出L3-L6节段背根神经节，运用实时荧光定量（RT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）检测Nav1.7在大鼠背根神经节中的表达水平。结果 各时相点中模型组大鼠背根神经节Nav1.7 mRNA及蛋白表达显著增加，与空白组比较有显著统计学意义（P＜0.01﹚。结论 福尔马林致炎性疼痛大鼠模型背根神经节中Nav1.7表达增强，与炎性疼痛相关。

福尔马林炎性疼痛；电压门控钠离子通道1.7；背根神经节；大鼠

电压门控钠离子通道1.7（Nav1.7）作为电压门控性钠离子通道的一个亚型主要选择性的允许钠离子跨膜通过，并由电压控制其开放，主要功能是维持细胞膜的兴奋性及其传导，且选择性高表达在伤害感受性脊髓背根神经节的感觉神经元上，在疼痛电信号的产生、传导和调控中具有重要的生理功能。本实验通过复制福尔马林炎性疼痛模型[1]，利用实时荧光定量和蛋白质印迹的方法观察Nav1.7在大鼠炎性疼痛模型背根神经节中的表达，为该模型疼痛产生机制的说明提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

一抗 （Anti-Nav1.7 antibody[mAbcam62758] ab62758）；二抗（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L)）。Nav1.7引物：上游：5'-CTTTGCAGCTGCCCTGGA-3'下 游 ：5'-CATGGCAATGAGCTGGACTTT-3'；β-actin引物：上游：5'-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3'下游：5'-CCGCTCATTGCCAATGGTGAT-3'。垂直电泳仪 （北京六一仪器厂DYCZ-24DN型）；湿式转膜装置（北京六一仪器厂DYCZ-40D型）；紫外分光光度计 （上海析谱UV-19）；核酸电泳仪（上海达平JY3000型）。

1.2 建模及分组[2]

选择健康成年雄性清洁级SD系大鼠24只，体质量250～280 g，购于湖南中医药大学实验动物中心。实验动物合格证号：syxk(湘)2009-0001。适应性喂养5 d后进行实验，随机分为空白组和模型组，建模方法同文献[2]，轻柔地限制动物，用微量注射器抽取5%福尔马林0.1 mL注入模型组大鼠左侧后足底皮下，空白对照组于左后足底注射0.1 mL生理盐水。操作完毕，立即将动物置于干净塑料箱内，与箱底成45°夹角放置一面镜子以便观察动物后肢的活动情况。

1.3 标本制作方法

两组大鼠于3个时相点 （造模后24、48、72 h）腹腔注射水合氯醛麻醉，解剖暴露大鼠脊柱，定位L3-L6椎体[3]，取出定位节段，纵向打开椎管，暴露背根神经节，依次取出，置入2 mL冻存管中，迅速保存于液氮中，后转入-80℃冰箱中备用。

1.4 实验指标测定

实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 采用RTPCR方法对背根神经节中Nav1.7mRNA表达水平进行检测。常规提取背根神经节中总RNA并进行琼脂糖凝胶电泳检测提取质量以及紫外分光光度仪测定RNA浓度及样本A260与A280比值，逆转录成cDNA后采用ABI 7500 Real time PCR仪进行PCR扩增，本实验内参选用β-actin，实验结果以2-△△CT表示，得出“±s”进行统计分析。

蛋白质印迹（Western blot）检测 采用Western blot方法对背根神经节中Nav1.7表达水平进行检查。常规提取背根神经节中总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量，电泳分离目标蛋白，电转移法转模，后用5%脱脂奶粉溶液封闭，孵育一抗及二抗（工作浓度1∶2 000倍）经ECL发光液显影，将显影后所得条带扫描并保存为电脑文件，用Image J图像分析软件对条带的灰度值进行分析，结果进行统计分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料“±s”表示。两组在1、2、3 d 3个时相点的实时荧光定量及蛋白质印迹结果均应用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

Nav1.7 mRNA在大鼠背根神经节中表现出稳定扩增状态，且在1、2、3 d 3个时相点中福尔马林模型组背根神经节Nav1.7 mRNA的表达量相对于空白对照组上升，比较差异有显著统计学意义（P﹤0.01），Nav1.7 mRNA的溶解曲线提示未出现非特异性扩增，结果见图1-2。

2.2 Western blot结果

在福尔马林模型组及空白对照组每个时相点中随机取3个样本进行蛋白质印迹检测，其Nav1.7蛋白表达随时相点的变化趋势与其基因表达趋势一致，在1、2、3 d 3个时相点中福尔马林模型组背根神经节Nav1.7蛋白表达量相对于空白对照组上升，比较差异有显著统计学意义（P﹤0.01）。结果见图3-4。

图1 Nav1.7溶解曲线图

图2 Nav1.7mRNA各时间点大鼠背根神经节表达（P﹤0.01）

图3 Nav1.7在各组大鼠背根神经节中的表达

3 讨论

福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型属经典疼痛造模，模型成功复制率高，其疼痛表现与临床实际表现相似，目前已在疼痛发生机制及镇痛药物机制中广泛应用。

图4 两组大鼠不同时相点Nav1.7蛋白相对表达量（P﹤0.01）

Nav1.7广泛地分布于脊髓背根神经节、交感神经元、施万细胞和神经内分泌细胞的细胞膜上，通过选择性的允许钠离子跨膜通过，并由电压控制其开放，维持细胞膜的兴奋性及其传导。近年来研究提示Nav1.7可能是存在于人类痛觉神经纤维上与疼痛的传入唯一有效的钠通道，如杨勇等[4]发现Nav1.7的SCN9A的突变导致了 “红斑性肢痛症”；Cox等[5]发现无痛症与Nav1.7的α亚基SCN9A突变相关，同时在大鼠炎症性疼痛模型中，大鼠背根神经节神经元上 Nav1.7出现表达增加的现象[6]，而将大鼠背根神经节神经元的Nav1.7基因敲除后，大鼠对炎症性疼痛的敏感性明显降低[7]。同时近来研究表明Nav1.7与炎性疼痛、神经病理性疼痛及癌性痛有密切的联系，如Wood等在基因敲除小鼠中的研究表明Nav1.7基因与急性痛和炎性痛的发展有密切相关[8]，Ghelardini等利用新合成 Tocainide类似物阻断Nav1.7通道显著抑制神经病理痛大鼠的痛过敏[9]，Diaz等证实前列腺癌细胞株中SCN9A基因呈高表达[10]，抑制Nav1.7则可以显著降低前列腺癌细胞[11]和宫颈癌细胞[12]的增殖、运动和侵袭能力。

本实验中Nav1.7在福尔马林模型组及空白对照组中有稳定的表达，且福尔马林模型组背根神经节中Nav1.7的表达水平相对于空白对照组上升，表明Nav1.7通道蛋白极有可能参与其疼痛信号传导，在该炎性疼痛模型发生机制中扮演重要角色。

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（本文编辑 杨 瑛）

Study of the Expression of Nav1.7 in Dorsal Root Ganglion of Formalin-induced Paw Inflammatory Pain Model

WANG Bo1,SHAO Xianfang2*,LIU Zhijun2,CHEN Shaojun2,LI Qian2,HE Yuanzhe1,ZHONG Jia2
(1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；
2.Changde Affiliated Hospital of HUCM,Changde,Hunan 410005,China)

Objective To investigate the Nav1.7 expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model of the rat.Methods24 Sprague-Dawley rats were divided into two groups:control rats(n=12)and formalin-induced paw inflammation rats(n =12).The controls were injected 0.1 mL NS,and formalin-induced rats were injected with 0.1ml saline formalin.L3-6 dorsal root ganglion were collected from rats.The expression of Nav1.7 was detected by real-time quantitative PCR and Western blot.Results Nav1.7 protein and mRNA expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model were significant higher than the control group(P<0.01﹚.Conclusion The Nav1.7 expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model of the rat was significant higherthan before.It might be have some association with inflammatory pain.

formalin inflammatory pain;Nav1.7;dorsal root ganglion(DRG)

R441.1；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.004.010.03

2013-10-08

湖南省常德市科技局一般项目（2011sk13）。

王 波，男，在读硕士研究生，研究方向：中医药防治创伤修复的研究。

*邵先舫，主任医师，教授，E-mail：756500827@qq.com。