抗癌防移片对4T1小鼠乳腺癌影响的研究

侯 超，胡志希*，曾柏荣，李 琳，陈龙娇

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3.广州中医药大学，广东 广州 510000）

抗癌防移片对4T1小鼠乳腺癌影响的研究

侯 超1，胡志希1*，曾柏荣2，李 琳1，陈龙娇3

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3.广州中医药大学，广东 广州 510000）

目的 观察抗癌防移片对4T1小鼠乳腺癌的影响。方法 建立4T1乳腺癌小鼠模型，随机分为空白对照组、模型组、环磷酰胺组和抗癌防移片组，分别给予药物或生理盐水，动态观察给药期间小鼠生活状况。给药4周后处死小鼠，测定小鼠体质量增加百分数，测量剥离瘤体积，计算瘤体积抑制率以及计数肺转移瘤灶个数。结果 与模型组比较，抗癌防移片组小鼠肿瘤生长缓慢，肺转移瘤灶数量明显减少（P＜0.05）；与环磷酰胺组比较，抗癌防移片组药物毒副作用小（P＜0.05），生活质量高，但其抑瘤防转移作用不及环磷酰胺（P＜0.05）。结论 抗癌防移片能抑制4T1小鼠乳腺癌生长与转移，改善小鼠生存质量。

抗癌防移片；4T1小鼠乳腺癌；肿瘤体积；瘤体积抑制率；肺转移瘤灶数

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，复发与转移是导致女性患者死亡的主要原因。研究证实，25%以上的乳腺癌一开始即发生血行远处转移，而通过淋巴道转移途径的机会则更多[1]。目前临床上防治乳腺癌复发与转移，主要采用化疗与内分泌治疗，但由于药物的毒副反应和耐药性，严重影响了治疗的效果。而抗肿瘤中药由于作用的多靶向性、毒副作用低且价廉，越来越受到患者的欢迎。

抗癌防移片系曾柏荣教授有效验方，以扶正祛邪为基本治则，调补肝脾、行气活血、祛痰化湿为治疗大法，用于临床防治乳腺癌术后复发与转移，收效明显[2]。为了证实该复方制剂的疗效并为其临床应用提供实验依据，我们观察了抗癌防移片对BALB/c小鼠4T1乳腺癌移植瘤模型的抑瘤防移效果及其毒副作用，现将方法与结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试药物 抗癌防移片由红参、半枝莲、黄芪、姜黄、重楼等16味中药组成，湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供。批号：20130521，规格：0.3 g/片，100片/瓶，每片含生药0.47 g；注射用环磷酰胺购于江苏恒瑞医药股份有有限公司，批号：201300830，规格：100 mg/瓶。

1.1.2 动物及瘤株 BALB/c小鼠48只，雌性，6～8周龄，体质量18～20 g，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK9(湘)2011-0003；自发转移性乳腺癌4T1细胞株，由湘雅医学院细胞培养室提供。

1.1.3 主要仪器 细胞培养超净工作台，厂家：美国Nuaire，型号：NV-425-400E；水套式C02培养箱，厂家：美国Shellab,型号：2406-2；倒置生物显微镜：厂家：南京江南光电股份有限公司，型号：XD-101。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组 参照文献方法进行造模[3]。将4T1乳腺癌细胞置于37℃和5%CO2充分湿化条件下用完全培养基培养并传代，取生长良好的细胞经胰酶消化后，将细胞浓度调整至1×106个/mL，随机取36只小鼠，于右侧第二乳头脂肪垫皮下注射瘤细胞数为2×105个/只。待肿瘤体积生长到直径约5 mm左右时，随机分为抗癌防移片组、环磷酰胺组与模型组，余12只未接种瘤细胞悬液小鼠作为空白对照组。

1.2.2 给药方法 小鼠每日以药液或生理盐水灌胃，同时每2日以药液或等体积生理盐水腹腔注射。给药剂量按人鼠体表面积折算法计算[4]，抗癌防移片组生药量为5.2 g/(kg·d)，每日予抗癌防移片悬浊液灌胃，同时每2日予生理盐水腹腔注射；环磷酰胺组每2日予环磷酰胺0.04 g/(kg·d)腹腔注射，同时予生理盐水灌胃；模型组与空白对照组予生理盐水灌胃，每2日予生理盐水腹腔注射，连续给药4周。

1.2.3 实验标本取材 末次给药结束后，次日清晨，称量体质量，脱颈处死小鼠，摘除肿瘤，剔除筋膜，切取部分瘤组织，切取体积约为 0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm （取材时避开瘤体中央液化坏死区与瘤体外周）后加入20%多聚甲醛固定，备行病理切片及免疫组化检测；开胸取肺脏，投入到Boains固定液（饱和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=75∶25∶5）中固定24 h后，用无水乙醇冲洗至肺组织颜色恢复。

1.3 检测指标

1.3.1 瘤体积与瘤体积抑制率 给药结束后，处死小鼠，完整剥离接种部位肿瘤，游标卡尺测量并计算瘤体积（VT）。计算公式为：VT=(a×b2)/2，a为肿瘤最长径，b为垂直于最长径的最大横径[5]。计算各组瘤体积抑制率公式：瘤体积抑制率（%）=（模型组平均瘤体积-治疗组平均瘤体积）/模型组平均瘤体积×100%[5]。

1.3.2 肺转移结节数与肺转移抑制率 处死小鼠后，开胸取出肺脏，将肺组织于Bouins固定液中固定24 h，再用无水乙醇浸泡至肺组织恢复颜色，摄像头放大镜下计数全肺结节数目。肺转移抑制率（%）=（模型组平均肺表面转移结节数-治疗组平均肺表面转移结节数）/模型组平均肺转移结节数× 100%。

1.3.3 生存质量与体质量增加率 给药期间，观察小鼠皮毛光泽度、活动灵活度；称得给药前和结束后体质量，体质量增加率=(实验结束后体质量-实验前体质量)/实验前体质量×100%，评估其营养改变情况。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠瘤体积与抑制率比较

空白对照组无肿瘤生长，与模型组比较，环磷酰胺组、抗癌防移片组剥离瘤体积缩小（P＜0.05）；抗癌防移片组剥离瘤体积大于环磷酰胺组 （P＜0.05）；抗癌防移片的瘤体积抑制率为35.68%，低于环磷酰胺组的70.13%。见表1。

表1 各组瘤体积与抑制率的比较

2.3 各组小鼠肺转移结节数与肺转移抑制率比较

与模型组比较，抗癌防移片组肺转移结节数显著减少（P＜0.05），多于环磷酰胺组（P＜0.05）。结果见表2，图1。

2.4 生存质量与体质量增加率比较

与模型组及环磷酰胺组比较，抗癌防移片组小鼠皮毛光泽，活动灵活，体质量增加率显著提高（P＜ 0.05）；与模型组比较，环磷酰胺组小鼠见皮毛欠光泽、反应迟钝、行动迟缓等毒副作用，体质量增加率有降低趋势（P＞0.05）。结果见表3。

表2 各组肺转移结节数及肺转移抑制率的比较

图1 各组小鼠肺组织转移瘤结节摄像放大图（×15）

表3 3组小鼠体质量增加百分率的比较

3 讨论

乳腺癌是危害妇女身心健康的重大疾病，目前以手术治疗为主，化疗、放疗为辅。近年来，乳腺癌的化疗已逐渐成为术后辅助治疗的首选方式，但由于化疗药物的滥用和肿瘤本身的异质性或其他原因，越来越多的肿瘤耐药性报道给乳腺癌的化疗带来很大挑战[6]。研究者们指出，化疗是否有效取决于癌细胞对化疗药物是否产生耐药性[7]。此外，乳腺癌化疗药物如紫杉醇、氟尿嘧啶的毒副反应也限制了其临床应用的普及[8]。目前，越来越多的肿瘤医家们将目光投向了多靶向性、毒副作用低且价廉的抗肿瘤中药研发。

中医学认为，乳腺肿瘤属“乳岩”、“乳石痈”等范畴，主要由正气亏虚、脏腑阴阳失调引发。《医宗必读》载：“积之成也，正气不足，而后邪气居之”。《医宗金鉴》云：“乳癌由肝脾两伤，气郁凝结而成”。中医学认为，影响乳癌等肿瘤复发、转移的关键因素是“伏邪”、“余毒”，肿瘤晚期或术后患者正气亏虚，潜伏之癌毒易乘虚而入，入络伤血，煎灼津液，致痰、毒、瘀互结，侵蚀脉道，最终导致癌症的复发与转移[9]。《瘟疫论》述：“若无故复发者，以伏邪未尽”。总之，乳癌属本虚标实之病，以肝脾虚弱、冲任失调为本，气滞血瘀、热毒蕴结、痰凝湿困为标，治疗上固本以补益肝脾、调补冲任为主，祛邪以行气活血、清热解毒、化痰祛湿为纲。基于这一处方思路，湖南中医药大学附属第一医院肿瘤科结合临床乳岩处方经验，研制出了抗癌防移片这一有效验方，该方由红参、黄芪、半枝莲、重楼、姜黄、莪术等16味中药组成，方中红参大补元气、养血安神，半枝莲清热解毒、散瘀定痛。红参得半枝莲竣补而不助邪，半枝莲得红参清解而不伤正，共为君药。臣以黄芪、女贞子、墨旱莲与枸杞子益气健脾、补益肝肾，白术、湘曲健脾开胃以增强红参补益之功，薏苡仁健脾祛湿、清热排脓，姜黄、莪术及九香虫行气化瘀以助半枝莲祛除病邪。综观全方，诸药大都归于肝、脾二经，使得湿热瘀毒得清，先天、后天之本得固，标本同治，符合肿瘤的治疗原则，临床上用于控制乳腺癌术后复发与转移，获得了可喜的疗效[2]。

本次研究通过皮下接种4T1乳腺癌细胞悬液成功建立BALB/c乳腺癌小鼠模型，观察了抗癌防移片对该模型抑瘤抗转移及改善生存质量的效应。结果显示：抗癌防移片组接种部位肿瘤体积较模型组显著缩小，乳腺癌肺转移瘤结节数较模型组也明显减少，与模型组比较，抗癌防移片组小鼠生活质量改善，体质量明显增加（6.58%VS 2.89%），差异均有统计学意义，证实了该复方既有抑制4T1小鼠乳腺癌生长与向肺部转移的作用，同时也能一定程度上增加小鼠体质量，改善小鼠生存质量，为抗癌防移片用于临床乳腺癌的治疗提供了依据。现代药理研究已证实，抗癌防移片组成药物如红参、半枝莲、黄芪、薏苡仁等所含的有效化学组分可通过调节免疫、抗血管生成、等多途径、多靶点发挥抗肿瘤的功效。如红参经由人参加工而来，与人参相比，增加了次生皂苷（ginsenoside-Rh2，由某些二醇组皂苷受热降解后生成）等特有成分，抑制肿瘤新生血管的形成作用明显提高[10]；半枝莲的抗肿瘤作用，也是通过主要成分黄酮类化合物、二萜类化合物等抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成并提高机体自身免疫力来体现[11]；黄芪抗肿瘤作用机制是多方面的，包括增强机体免疫功能、直接抑瘤作用、促进肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤血管生成、影响机体的氨基酸代谢等，该药所含有的多糖类成分是发挥作用的主要活性物质[12]；薏苡仁味甘、淡、性凉，现代药理研究发现其通过降低血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）的表达来抗肿瘤血管生成从而达到抑制肿瘤功效[13]。因而，直接细胞毒作用、抑制肿瘤血管生成及调节机体免疫功能等作用途径的综合效应很可能是抗癌防移片抑制肿瘤生长与转移的机制所在，而该复方制剂的综合效应是否是各组分作用的简单相加，其中哪些作用机制占主导地位，仍有待后续实验研究进一步探讨。

[1]蒋国梁，叶定伟，李 进，等.常见恶性肿瘤的多学科综合诊断和治疗[M].上海：复旦大学出版社，2011：110-111，122-125.

[2]周 斌，曾柏荣，刘 华.抗癌防移片对Ⅲ期乳腺癌患者无进展生存期影响的研究[J].中医药导报，2011，17(11)：11-15.

[3]Polyzos A,Zhang R D,et al.Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice[J].Cancer Res，1990，50(3)：717-721.

[4]贺石林，王 键，王净净，等.中医科研设计与统计学[M].长沙：湖南科学技术出版社，2001：49.

[5]周际昌.临床用药丛书·抗癌药物的临床应用[M].北京：化学工业出版社，2001：343.

[6]王铁军，耿 慧，祝永刚，等.乳腺癌化疗现状及相关研究进展[J].现代生物医学进展，2013，13(22)：4 398-4 400.

[7]石 晶，腾月娥，赵明芳，等.乳腺癌耐药相关蛋白与多药耐药关系的研究进展[J].实用临床医药杂志，2009，13(1)：88-91.

[8]罗兰T.斯基尔.癌症化疗手册[M].北京：科学出版社，2010：382-394.

[9]李焕荣，李秀荣.中医药抑制肿瘤血管生成抗肿瘤转移的可行性探讨[J].中西医结合学报，2007，5(4)：378-381.

[10]张 翔，叶宝东，陈 丹，等.人参皂苷Rg3抗肿瘤机制研究进展[J].中华中医药学刊，2013，31(2)：328-330.

[11]兰 波，杨 雪，胡 荣，等.半枝莲抗肿瘤和免疫调节作用研究进展[J].重庆中草药研究，2011，64(2)：49-52.

[12]丁 繁，王小虎.中药黄芪抗肿瘤研究进展 [J].肿瘤学杂志，2013，19(1)：64-68.

[13]杜 萌，丁安伟，陈 彦.薏苡仁化学成分及其防治肿瘤作用机制研究[J].吉林中医药，2012，32(2)：195-198，201.

（本文编辑 徐爱良）

Experimental Study of Kang'ai Fangyi Tablet's Curative Effect Against 4T1 Mice Breast Cancer

HOU Chao1,HU Zhiχi1,ZENG Borong2,LI Lin1,CHEN Longjiao3
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan,410208,China;
2.The First Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan,410007,China;
3.Guangzhou university of Chinese medicine,Guangzhou,Guangdong,510000,China)

Objective To observe the effect of Kang'ai Fangyi Tabelt on 4T1 breast cancer of mice.Methods The mouse model of 4T1 breast cancer was established.The experimental mice were divided into four groups randomly which were called control group,model group,cytoxan group and Kang'ai Fangyi Tablet group;and then,gave a regular injection of cytoxan,Kang'ai Fangyi Tabelt or saline to the mice,respectively,except control group.The living condition of mice during administration was observed in a dynamic way.After four weeks,the mice was killed and the percentage of physique gain,the volume of tumor,the inhibition rate of tumor volume and the number of lung metastases were calculated.Results 1)Compared with the model group,the tumor of Kang'ai Fangyi Tabelt group mice grew slowly with less pulmonary metastasis tumor(P<0.05);2)Compared with cytoxan group,the negative effect of Kang'ai Fangyi Tabelt group is less significantly(P<0.05),having better quality of life,but the function of Cytoxan's tumor inhibition and prevention of tumor metastasis was stronger.Conclusion Kang'ai Fangyi Tabletcan inhibitthe growth and metastasisof4T1 breastcancer,improving the quality of mouse life.

Kang'ai Fangyi Tabelt;4T1 mice breast cancer;tumor volume;the inhibition rate of tumor volume;the number of lung metastasis

R285.5；R737.9

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.003.006.04

2013-11-26

国家自然科学基金资助项目(81373550)；湖南省高校创新平台开放基金重点项目(11K049)。

侯 超，男，在读硕士研究生，研究方向：从事中医肿瘤证治规律研究。

*胡志希，教授，博士研究生导师，E-mail：515800272@qq.com。