抵当汤对阿尔茨海默病大鼠脑组织端粒酶活性的影响

王康锋　张立娟　孙西庆等

[摘要] 目的 观察抵当汤对阿尔茨海默病（AD）大鼠脑组织端粒酶活性及学习记忆能力的影响。 方法 40只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组和抵当汤组。采用右侧海马注射Aβ25-35方法制备AD大鼠模型，治疗组采用抵当汤治疗，对照组给予多奈哌齐，均连续灌胃给药，疗程为8周，采用跳台实验观察各组大鼠学习记忆能力的改变。实验结束后处死大鼠，采用ELISA检测脑组织端粒酶活性。 结果 实验结束后各用药组逃避潜伏期较模型组明显延长，错误次数明显减少（P<0.05，P<0.01），抵当汤组较多奈哌齐组错误次数减少更明显（P<0.05）；与模型组比较，抵当汤组和多奈哌齐组脑组织端粒酶活性明显提高（P<0.05，P<0.01），抵当汤组较多奈哌齐组提高更明显（P<0.05）。 结论 抵当汤可显著改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与该方提高大鼠脑组织端粒酶活性有关。

[关键词] 抵当汤；阿尔茨海默病；端粒酶；学习记忆

[中图分类号] R289.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）04（b）-0011-03

[Abstract] Objective To observe the influence of Didang Decoction on telomerase activity and the ability of learning and memory of brain tissue in rats with Alzheimer disease（AD）. Methods 40 male Wistar rats were randomly divided into the pseudo operation group，model group，donepezil group and Didang decoction group.AD rats model was made by the method of injecting A beta 25-35 in the right hippocampus.The Didang decoction group was treated by used Didang decoction， the donepezil group was treated by donepezil，the rats，all groups were given continuous intragastric administration for 8 weeks，after the medication step down test was performed to observe the changes of learning and memory ability in different groups of rats.After the experiment，the rats were sacrificed and ELISA was used to detect telomerase activity in brain tissue. Results Compared with the model group，the escape latent period of rats in each treatment group was prolonged significantly （P<0.05，P<0.01），error number was decreased obviously，it was more significantly decreased in the Didang decoction group compared with that in the donepezil group（P<0.05）；compared with the model group，the telomerase activity of the Didang decoction group and donepezil group increased significantly （P<0.05，P<0.01），and it was more significantly increased in Didang decoction group compared with that in the donepezil group （P<0.05）. Conclusion Didang decoction can significantly improve the learning and memory ability of rats with AD，and its mechanism may be related to this prescription increasing telomerase activity in brain tissue of rats.

[Key words] Didang decoction；Alzheimer disease；Telomerase；Learning and memory

抵当汤是张仲景创立的理血名方，至今仍在临床被广泛使用，本方由桃仁、大黄、水蛭、虻虫组成，原为下焦蓄血证所设。经过历代医家的不断发展，本方应用范围不断扩大，目前已被应用于泌尿系疾病、心脑血管疾病、妇科疾病等数十种疾病。我们受本方主治“如狂”“喜忘”等症状的启发，采用抵当汤治疗阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）取得了满意的效果，总有效率达80.0%，明显优于西药对照组[1]，但本方治疗AD的基础研究目前还十分薄弱，本研究通过Aβ25-35海马区注射建立AD动物模型并用抵当汤进行干预，观察本方对AD大鼠脑组织端粒酶（telomerase）活性及学习记忆能力的影响，探讨其疗效机制。

1材料与方法

1.1 药物与试剂

抵当汤药物组成：桃仁12 g，水蛭6 g，虻虫6 g，大黄9 g。水煎后浓缩至每毫升含生药3 g备用。盐酸多奈哌齐片[安理申，卫材（中国）药业有限公司，批号130536A]。Aβ25-35购于Sigma公司。大鼠端粒酶（TE）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购于美国R&D公司。

1.2 仪器

脑立体定向仪（江湾1号C型，上海川沙花木农机厂），酶标仪（352型，芬兰Labsystems Multiskan MS），洗板机（AC8型，芬兰Thermo Labsystems），微量高速离心机（TG16W，湖南长沙平凡仪器仪表有限公司），隔水式恒温培养箱（GNP-9080型，青岛正恒试验设备有限公司），大鼠跳台仪（自制）。

1.3 动物

雄性Wistar大鼠40只，清洁级，体质量200～250 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及给药 将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组、抵当汤组，每组各10只。治疗药物及对照药物参考临床用药情况，按成人（60 kg）日用药量的10倍量折算成大鼠使用剂量。造模次日开始灌胃给药，1次/d。假手术组及模型组用等体积生理盐水灌胃，疗程均为8周。

1.4.2 动物模型的建立 参考文献[2]方法大鼠用10%水合氯醛（3～3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉后头部固定于立体定向仪，常规消毒后暴露颅骨，以右侧海马为注射区，定位坐标：前囟后3.0 mm，中线右侧2.0 mm，硬膜下2.6 mm。将1 μl聚集态Aβ25-35（10 μg/μl）缓慢注入，注射时间5 min，留针5 min，术后缝合切口。

1.4.3 跳台实验 跳台实验于造模后及用药后各进行1次。训练时将大鼠分别放入自制大鼠跳台仪内，先适应环境3 min，然后通以36 V交流电，大鼠受电击后，正常反应是跳上跳台以逃避电击。训练5 min，记录大鼠第一次跳下时触电潜伏期，并记录5 min内触电次数作为错误反应次数，以此作为学习成绩。24 h后重新测试，记录第一次跳下平台的触电潜伏期和5 min内触电次数，此即记忆保持成绩。

1.4.4 端粒酶活性检测 大鼠处死后快速取出大脑，以生理盐水制成10%组织匀浆用于检测端粒酶活性，采用ELISA，具体方法参考试剂盒说明书进行。

1.5统计学处理

所得数据用SPSS 19.0统计学软件作统计分析，样本均数间比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组跳台实验结果的比较

实验结束后各用药组逃避潜伏期均较模型组明显延长，同时5 min内错误次数明显减少（P<0.05，P<0.01），抵当汤组错误次数减少更明显，与多奈哌齐组比较，差异有统计学意义（P<0.05），逃避潜伏期虽较多奈哌齐组延长，但无统计学意义（P>0.05）（表1）。

3 讨论

AD是一种发生于中老年的原发性脑退行性变性疾病。本病在老年人群中发病率高，是现代社会最常见的老年性中枢神经系统疾病之一，严重威胁了老年人的生命和健康。目前中国60岁以上人群AD发病率已高达3%～5%[3]，全球每年新增加460万AD患者[4]。随着世界人口老龄化程度的提高，AD患病率不断增高，本病引起的社会问题和经济问题必将日益严峻。

AD既往虽然有胆碱能损伤[5]、自由基[6]、兴奋性氨基酸毒性[7]、炎症免疫[8]、细胞凋亡[9]等假说，但均未能完全阐明其发病机制，近年来端粒酶与AD的关系备受关注。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体，是一种依赖RNA的逆转录酶，在维持端粒的长度方面起重要作用。在AD发病与患者PBLs端粒长度的研究中，Jenkins等[10]对比了18例Down综合征妇女的PBLs端粒长度，提示合并有AD的患者端粒较短。Honig等[11]也观察到了AD组PBLs端粒较短，同时发现端粒长度越短，研究对象死亡率越高。端粒与认知功能的关系亦有初步研究，Valdes等[12]对382名双胞胎妇女的研究发现具有较长端粒的学习记忆能力较强，端粒较短者易出现认知功能的下降。Yaffe等[13]对2734个非AD老人进行了7年的前瞻性研究，发现端粒较长者认知功能评定得分下降最少，端粒较短者得分下降较多，认为PBLs端粒长度或许可以作为评价认知功能状态的指标之一。

抵当汤是张仲景治疗下焦蓄血证的经典方剂，临床广为应用，如《伤寒论》第237条云“阳明证，其人喜忘者，必有蓄血，所以然者，本有久瘀血，故令喜忘，屎虽硬，大便反易，其色必黑者，宜抵当汤下之。”本方主治的“如狂”“喜忘”等症状与AD的临床表现极为相似，我们以此为借鉴，临床上采用本方治疗AD取得了满意的疗效[1，14]。关于本方治疗AD的作用机制也有部分学者进行了研究，抵当汤能显著提高老年大鼠的记忆保存率，具有明显的改善记忆作用[15]，目前认为其疗效与改善血液循环、调节血脂、抗氧化及保护内皮功能等作用有关[16-17]。本研究结果显示，抵当汤可以明显提高AD大鼠学习记忆能力，延长大鼠跳台潜伏期，减少5 min内错误次数，与文献报道结果一致[15]。同时本方可以显著提高AD大鼠脑组织端粒酶活性，明显优于对照药物多奈哌齐，这可能是抵当汤治疗AD的机制之一。

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（收稿日期：2014-03-14 本文编辑：许俊琴）

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（收稿日期：2014-03-14 本文编辑：许俊琴）

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（收稿日期：2014-03-14 本文编辑：许俊琴）