玉米胚芽蛋白提取及组成成分分析

王 霞 丁继峰 鹿保鑫 张东杰

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(黑龙江省双鸭山市友谊县食品药品监督管理局2，双鸭山 155800)

蛋白质是人体维持正常生命活动最基本的物质，人体每天必须从食物中摄取一定量的蛋白质，补充必需氨基酸的摄入量，从而维持人体的正常生活和生命需要[1-3]。玉米胚芽含有丰富的脂肪和蛋白资源，其中胚芽蛋白具有良好的功能性质，可以作为食品添加剂添加到食物当中从而改善食物的感官和组织特性，提高产品品质，提高营养价值，玉米胚芽中蛋白质质量分数在20%左右，主要为白蛋白和球蛋白，且玉米胚芽蛋白中富含多种人体必需氨基酸，其中赖氨酸和色氨酸含量相对较高，特别是赖氨酸高达5.8%左右[4-5]。本研究首先采用超临界CO2萃取方法制备脱脂玉米胚芽粉，利用酶法和碱溶酸沉法[6-11]相结合的提取玉米胚芽粉中的蛋白。探讨酶添加量、提取温度和pH等因素对玉米胚芽蛋白提取率的影响，对试验条件进行了优化组合，对提取物中氨基酸组成进行了测定。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

脱脂玉米胚芽粉：自制。α-淀粉酶：北京奥得星生物技术有限公司；氢氧化钠：南京化学试剂有限公司；盐酸：南京化学试剂有限公司；SDS(十二烷基磺酸钠)：北京康倍斯科技有限公司；Acr(丙烯酰胺)：北京康倍斯科技有限公司；甘氨酸：天津市东丽区天大化学试剂厂；溴酚蓝：天津市东丽区天大化学试剂厂；考马斯亮蓝R250：上海化学试剂有限公司等；以上均为分析纯。

1.2 主要仪器

HA121-50-01超临界流体萃取装置：南通市华安超临界萃取有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；F-160粉碎机：北京市永光明医疗仪器厂；DELTA 320 型酸度计：梅特勒—托制多仪器(上海)有限公司；SPD50自动定氮仪：北京三品科技仪器有限公司；L-8800全自动氨基酸分析仪：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工艺流程

玉米胚芽→脱除脂肪→玉米胚芽蛋白提取液→调节pH 9.0→加温搅拌→3次离心→提取上清液→调pH 6.3加α-淀粉酶→65 ℃酶解→调pH→2次离心→沉淀脱盐→蛋白含量测定

1.3.2 单因素试验设计

选择对玉米胚芽蛋白提取效果有影响的4个主要因素：α-淀粉酶添加量X1，提取温度X2，酶解时间X3，酸沉pHX4，以蛋白提取率为考核标准，进行单因素试验。

1.3.3 二次回归正交旋转组合设计试验

在单因素试验的基础上，确定中心组合因素(α-淀粉酶添加量、提取温度、酶解时间、提取pH)与水平。以玉米胚芽蛋白提取率为响应值，通过二次回归正交旋转试验对提取条件进行优化。变量参数P=4；星号臂值R=2；±1水平的因素点试验全部实施为Mc=2P=16；±R水平的星号臂点为MR=2P=8；为了使得二次旋转组合设计具有正交性，各因素是零水平的中心为M0=12；总试验点N=MC+MR+M0=36。

1.3.4 玉米胚芽蛋白提取率的测定

玉米胚芽提取率=

1.3.5 玉米胚芽蛋白的电泳检测

采用垂直板电泳，根据表1浓缩胶分离胶配方依次灌胶，制备样品，混匀冷却后上样，在90 V恒流条件下1 h，后100 V恒流条件下电泳3 h。电泳完毕后染色、脱色直至背景清晰为止。

1.3.6 玉米胚芽蛋白的氨基酸组分测定

大多数氨基酸与茚三酮衍生物呈蓝紫色，在570 nm处有最大吸收；脯氨酸与茚三酮衍生物呈黄色，在440 nm处有最大吸收，根据这一特点，采用氨基酸全自动分析仪，进行玉米胚芽蛋白的氨基酸组分测定。

2 结果与讨论

2.1 玉米胚芽蛋白提取单因素试验结果

2.1.1 α-淀粉酶添加量对玉米胚芽蛋白提取率的影响

图1中的试验条件为玉米胚芽溶液的料液比为1∶10，提取温度为65 ℃，酸沉pH为4.0，酶解时间2 h，α-淀粉酶添加量分别在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%进行研究，从图1可以看出，α-淀粉酶的添加量在0.1%～0.3%之间时，随着α-淀粉酶添加量的增加玉米胚芽蛋白提取率而显著增加，在添加量为0.3%时，提取率达到最高值62.81%。继续增加α-淀粉酶添加量时，蛋白提取率有所下降。因此选取α-淀粉酶的最适添加量为0.3%。

图1 α-淀粉酶添加量对玉米胚芽蛋白提取率的影响

2.1.2 提取温度对玉米胚芽蛋白提取率的影响

图2中的试验条件为玉米胚芽溶液的料液比为1∶10，α-淀粉酶添加量为0.3%，酸沉pH为4.0，酶解时间2 h，提取温度分别25～75 ℃进行试验以测定玉米胚芽蛋白的提取率，其中提取温度在25～65 ℃之间时，玉米胚芽蛋白提取率随着提取温度的上升而显著增加，在温度为65 ℃时，蛋白提取率达到最大为61.74%。继续升高时，蛋白提取率有所下降，可能是因为过高的温度使蛋白的结构发生改变甚至变性所致。根据温度对玉米胚芽蛋白提取率的影响关系曲线选取最适提取温度为65 ℃。

图2 提取温度对玉米胚芽蛋白提取率的影响

2.1.3 酶解时间对玉米胚芽蛋白提取率的影响

图3的试验条件为玉米胚芽溶液的料液比为1∶10，提取温度为65 ℃，在α-淀粉酶添加量为0.3%，酸沉pH为4.0，酶解时间分别为0.5～2.5 h条件下进行试验，随着酶解时间延长，玉米胚芽蛋白提取率逐渐增加，在2 h以后达到平衡，继续延长酶解时间对蛋白提取率的提高影响不大。根据酶解时间对玉米胚芽蛋白提取率的影响关系曲线选取最适酶解时间2 h。

图3 酶解时间对玉米胚芽蛋白提取率的影响

2.1.4 PH对玉米胚芽蛋白提取率的影响

图4中试验条件为玉米胚芽溶液的料液比为1∶10，提取温度为65 ℃，在α-淀粉酶添加量为0.3%，酶解时间为2h，酸沉pH为3.0～5.0，进行试验，在pH在4.0时，蛋白提取率达到最大为61.99%。pH在小于或者大于4.0时，蛋白提取率较低，说明玉米胚芽蛋白的等电点在4.0左右，偏离等电点时，一部分蛋白重新被溶解，蛋白含量有所降低。因此选择pH为4.0做为二次回归正交旋转试验的最优水平。

图4 pH对玉米胚芽蛋白提取率的影响

2.2 二次回归正交旋转组合设计试验结果

2.2.1 二次回归正交旋转组合试验结果

二次回归旋转组合试验设计及结果见表1、表2。

表1 试验因素水平编码表

表2 试验设计及结果

表2(续)

回归方程的方差分析及F检验和t检验结果分别见表3、表4和表5。

表3 F检验分析表

表4 回归方程各项的方差分析表

表5 t检验方差分析表

对试验数据进行回归分析，以玉米胚芽蛋白提取率作为衡量指标即Y值，得到以4种影响因素的编码值为自变量的回归方程如下：

Y=-390.655 764+124.684 945X1+9.891 081X2+27.151 451X3+46.218 900X4-151.078 556X12+1.270 573X1X2-0.091 431X22-23.998 524X1X3+0.112 030X2X3-9.704 570X32-14.894 267X1X4+0.262 115X2X4+3.640 295X3X4-8.243 142X42

回归方程显著性分析结果：F1=38.57>F0.01=3.03，说明差异极显著。失拟性检验F2=2.27

2.2.1.1主效应分析

4种因素对玉米胚芽蛋白提取率的影响程度见表6，由表可以得出4种因素对玉米胚芽蛋白提取率的影响顺序为：X2>X3>X1>X4，即提取温度对玉米胚芽蛋白提取率影响最大，酶解时间次之，再次为α-淀粉酶添加量，pH对其影响最小。

表6 关键因子重要性分析

2.2.1.2 模拟寻优及验证

对回归方程进行计算机模拟寻优，结果见表7，得到玉米胚芽蛋白的最佳提取条件为：α-淀粉酶添加量0.31%，提取温度63.29 ℃，酶解时间2.12 h，pH 3.99，理论蛋白提取率为63.12%。根据实际操作情况，α-淀粉酶添加量0.3%，提取温度63 ℃，酶解时间2 h，pH4.0，为条件进行验证，实际蛋白提取率为61.86%，误差为2%≤5%，说明优化模型拟合较好。

表7 试验结果

注：3次测定值分别为61.79%、61.86%、61.92%的平均值。

2.2.2 玉米胚芽蛋白电泳检测结果

对所提取的玉米胚芽蛋白进行SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示，根据标准蛋白所作的半对数标准曲线，接合各蛋白迁移率Rf值，可算出玉米胚芽蛋白的分子质量为94.5、72.3、55.8、30.2 ku，说明提取的玉米胚芽蛋白并不是单一蛋白。

图5 蛋白电泳图

2.2.3 玉米胚芽蛋白的氨基酸组成测定结果

在酸性条件下，经氨基酸全自动分析仪检测，玉米胚芽蛋白中含有7种人体必需氨基酸，见图6和表8。

图6 氨基酸色谱分离图

表8 人体所需8种氨基酸与玉胚芽蛋白所含氨基酸对照表

注：+表示含有该种氨基酸，—表示不含该种氨基酸。

3 结论

玉米胚芽经过超临界CO2萃取脱脂后进行蛋白提取试验，在提取过程中添加α-淀粉酶，通过单因素试验考察了α-淀粉酶添加量、提取温度、酶解时间以及酸沉pH 4个因素对提取玉米胚芽蛋白提取率的影响，并在此单因素试验基础上进行四元二次旋转回归组合试验对提取条件进行优化，玉米胚芽蛋白的最佳提取条件为：α-淀粉酶添加量0.3%，提取温度63 ℃，酶解时间2 h，pH4.0，所制得玉米胚芽蛋白产品提取率为61.86%。经过电泳检测可计算出玉米胚芽蛋白的分子质量为94.5、72.3、55.8、30.2 ku，说明提取的玉米胚芽蛋白并不是单一蛋白。在酸性条件下，经氨基酸全自动分析仪测定，玉米胚芽蛋白中含有7种人体必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。

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