用API 50CH系统鉴定9株产高光学纯度D-乳酸野生菌株

姚纲 张健鹏 胡红焱 梁慧

D-乳酸(右旋乳酸)作为一种重要的化工原料, 在食品、医药、高分子材料等领域有着广泛的用途, 具有重要的经济价值［1］。乳酸的生产大多采用发酵法, 发酵法制备D-乳酸的主要技术瓶颈是缺乏产高光学纯度(光学纯度>97%)D-乳酸的菌株［2］。作者从某发酵食品中分离并纯化出9株野生菌株, 产D-乳酸光学纯度达100%, 将其命名为SZD菌株, 初步鉴定为乳杆菌属(lactobacillus)。本文拟利用API 50CH鉴定系统对这9株野生菌株进行进一步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 9株SZD菌株均分离自陕西的一种发酵食品, 编号分别为 SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-6、SZD-8、SZD-9、SZD-10, 其中具有代表性的4株(SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏编号分别为：CGMCC No.6891～6894。

MRS肉汤培养基基础(北京奥博星生物技术有限责任公司), API50 CHL培养基及API50 CH碳水化合物鉴定试剂条均购自法国生物梅里埃公司。

1.2 方法 按照API50 CH碳水化合物鉴定试剂条说明书进行。先制备相当于2个麦氏浊度的SZD菌株的菌悬液, 然后将菌悬液加到试剂条上的50个微生化管中, 最后用无菌液体石蜡封管静置35℃培养, 24 h及48 h各观察1次结果。试剂条变为黄色(25号管变为黑色)为阳性反应, 变为绿色(25号管除外)为弱阳性反应, 不变色为阴性反应, 以48 h观察到的结果作为最终结果。

2 结果

SZD菌株的碳水化合物发酵试验结果见表1。

表1 SZD菌株碳水化合物发酵试验结果

3 讨论

形态特征、生理生化反应及代谢产物等表型特征是鉴定细菌最基本的依据。通过前期研究得知, 9株SZD菌株均为G+短杆菌, 无芽孢, 无分叉, 无动力, 兼性厌氧, 能在pH值为4.5的培养基中生长, 15℃生长良好, 45℃迟缓生长, 接触酶及氧化酶均为阴性, 不产吲哚和硫化氢, 不液化明胶, 从葡萄糖产乳酸但不产气。根据以上表型特征, SZD菌株鉴定为乳杆菌属, 但无法将其鉴定至种的水平［3］。

乳酸杆菌种水平的表型鉴定主要依据碳水化合物发酵试验。传统的发酵试验需配制或购买各种生化反应管, 费时费力, 且反应管种类较少, 使结果的判定受限。法国梅里埃公司研发的API 50CH鉴定系统专用于乳酸杆菌和相关菌的鉴定, 是世界范围内应用最广、种类最全、最受微生物学家推崇的国际标准化产品。一个试剂条包括49种碳水化合物的发酵反应, 接种菌后反应48 h即可判定结果。该系统试剂反应灵敏, 方法简单快捷, 鉴定结果可靠［4,5］。该系统的缺点是价格昂贵, 不适于大规模菌种的鉴定, 而且鉴定到种水平的分辨力有限。Corsetti A等［6］利用API 50CH鉴定系统分析了317株可能为乳酸菌的菌株, 结果仅38%分离株被鉴定到种的水平。作者采用这一鉴定系统对9株SZD菌株进行的碳水化合物的发酵试验结果表明, 所有SZD菌株均发酵甘露醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖及甘露糖, 除SZD-4外均发酵麦芽糖, 部分菌株(SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-9)发酵葡萄糖盐。所有菌株不发酵乳糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、松三糖、木糖及海藻糖, 根据以上特性, 将SZD菌株鉴定为棒状乳杆菌(lactobacillus coryniformis)。

目前棒状乳杆菌分为棒状亚种(lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)和扭曲亚种(lactobacillus coryniformis subsp.torquens)。棒状乳杆菌棒状亚种大部分(>90%)发酵鼠李糖, 部分(11%～89%)水解七叶灵并发酵水杨苷、山梨醇、蜜二糖、棉子糖。棒状乳杆菌扭曲亚种大部分(>90%)不水解七叶灵, 大部分(>90%)不发酵鼠李糖、水杨苷、山梨醇、蜜二糖、棉子糖［7-9］。所有SZD菌株均水解七叶灵并发酵水杨苷, 部分菌株(SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-10)发酵山梨醇, 与棒状乳杆菌扭曲亚种的特性不符；所有SZD菌株不发酵蜜二糖、棉子糖, 除SZD-3外均不发酵鼠李糖, 与棒状乳杆菌棒状亚种的特性不符。因此, SZD菌株不能鉴定为棒状乳杆菌两个已知亚种的任何一种, 很可能为棒状乳杆菌一个新的亚种。SZD菌株分类地位的最终确定还需利用分子生物学技术对其基因型特征进行鉴定。

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