二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞Rac1-Pak1／Rock1通路的影响

何 慧，马艳华，2，苏 波，向姝霖，姜 浩，杨邦敏，章 硕，夏 红，苏 琦

（1.湖南省胃癌研究中心，南华大学附属第一医院，肿瘤研究所，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南衡阳 421001；2.海南省第三人民医院，海南三亚 572009）

二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜烯丙基硫化物中的一种脂溶性有效成分，具有多种抗肿瘤作用［1］。本实验室先前工作证明，DADS可抑制人胃癌细胞增殖抑制与诱导分化［2－6］。最近，我们报道DADS可抑制人胃癌细胞迁移侵袭，且能下调LIMK1、MMP-9，上调 TIMP-3，提示 DADS抗胃癌细胞迁移侵袭与干预 Rac1／LIMK1通路有关［7－8］。在前期工作的基础上，本研究进一步探讨DADS对LIMK1上游信号分子Rac1-Pak1／Rock1的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞 人胃癌MGC803细胞系南华大学肿瘤研究所保存。培养于10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2的恒湿培养箱中，2 d传代1次。

1.2 试剂 DADS：Fluka公司产品，纯度80%，与Tween 80以1∶2比例充分溶解，加入体积分数为0.90的生理盐水稀释100倍，作为母液保存于－20℃冰箱中。小牛血清（杭州四季青生物工程公司），RPMI 1640培养基（Gibco公司），Total RNA Kit（Omega公司），RT试剂盒（Invitrogen公司），PCR试剂（Promega公司）。BCA蛋白定量检测试剂盒（Pierce公司），ECL发光检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），cofilin1、Phospho-cofilin1多克隆抗体（ABZOOM公司）。Rac1单克隆抗体（MILLIPORE公司），ROCK1与PAK1单克隆抗体（Epitomics公司），Destrin多克隆抗体（Abcam公司）。羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（KPL公司）。

1．3 RT-PCR Total RNA Kit提取细胞总RNA，在AMV酶作用下逆转录合成cDNA。设计并合成PCR扩增引物。Rac1：F 5′-CCCTATCCTATCCGCAAACA-3′，R 5′-CGCACCTCAGGATACCACTT-3′，扩增片段100 bp；Pak1：F 5′-AAGACATCCAACAGCCAGAA-3′，R 5′-TGTAGCCACGTCCCGAGT-3′，扩增片段 255 bp；Rock1：F 5′-AAAACCTTATTTGTGCCTTCC-3′，R 5′-CGTTTCCCAAGCCCACT-3′，扩增片段 113 bp；cofilin1：F 5′-CAAGAAGGCGGTGCTCT-3′，R 5′-ACAA AGGTGGCGTAGGG-3′，扩增片段 120 bp；Destrin：F 5′-TGGTTGGAGATGTTGGTG-3′，R 5′-TACAAGCCC GATTGAGAT-3′，扩增片段 276 bp；β-actin：F 5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3′，R 5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′，扩增片段 367 bp。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像系统拍照，AlphaImager 2200软件扫描，相对光密度（ROD）代表基因表达丰度，以 LIMK1／β-actin表达丰度计算平均光密度值。

1．4 Western blot 收集细胞，冰PBS洗两次，1×107个细胞加入 100μl裂解液（100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF），冰上裂解 1 h，12 000 r·min－1离心 10 min，吸出上清液，即细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白含量，分光光度计在570nm波长处测定光吸收值，以溶剂为空白对照，牛血清白蛋白为标准绘制曲线，依据标准曲线推算蛋白含量。使蛋白变性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的 TBST（Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含 0.1%Tween-20）封闭 1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定光密度值。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件One-Way Anova或t检验进行统计学处理。

2 结果

2．1 DADS对人胃癌MGC803细胞Rac1表达的影响 如 Fig 1所示，用30 mg·L－1DADS处理MGC803细胞12h，Rac1 mRNA水平与对照组（0 h组）差异无显著性，而 DADS作用细胞 48h后，Rac1mRNA水平明显下调（P＜0.01）；Western blot检测结果显示，用DADS处理细胞12和24 h，Rac1蛋白水平无明显改变，而在36和48 h时则明显下调（P＜0.05）。以上结果表明DADS处理细胞24 h后，对Rac1基因的转录和蛋白表达具有抑制作用。

2．2 DADS对人胃癌MGC803细胞Pak1表达的影响 如Fig 2所示，与对照组比较，用30 mg·L－1DADS处理MGC803细胞12 h，Pak1 mRNA水平无变化，而在48 h时则明显下降（P＜0.01）；Pak1的蛋白表达在12 h无明显改变，而在处理细胞24、36和48 h时，其蛋白表达呈时间依赖性降低（P＜0.01）。上述结果表明，DADS可下调Pak1基因与蛋白表达。

2．3 DADS对人胃癌MGC803细胞Rock1表达的影响 RT-PCR结果显示，与对照组比较，DADS处理细胞12和48 h，Rock1 mRNA水平均下降（P＜0.01）（Fig 3A）；Rock1蛋白水平在24、36和48 h时呈时间依赖性下降（P＜0.01）（Fig 3B），表明DADS同样可抑制Rock1基因的转录和蛋白表达。

Fig 1 Effects of DADS on Rac1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

2．4 DADS对人胃癌MGC803细胞cofilin1表达的影响 DADS处理MGC803细胞12和48 h后，cofilin1 mRNA水平与对照组比较，差异没有显著性（P＞0.05）（Fig 4A）。cofilin1蛋白水平在 12、24、36和48 h处理后差异也无显著性（P＜0.05），但磷酸化cofilin1水平则在DADS处理细胞24、36和48 h后呈时间依赖地下降（P＜0.01）（Fig 4B），表明DADS可抑制MGC803细胞cofilin1的磷酸化。

Fig 2 Effects of DADS on Pak1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

Fig 3 Effects of DADS on Rock1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

2．5 DADS对人胃癌MGC803细胞destrin表达的影响 如Fig 5所示，与对照组比较，DADS处理MGC803细胞后，destrin在转录和蛋白水平变化均无显著性（P＞0.05），表明DADS对destrin表达无影响。

3 讨论

Rho GTPase-Pak／Rock-LIMK信号通路主要参与肌动蛋白功能和细胞骨架重组的调节，与肿瘤细胞迁移侵袭关系密切。Rho GTPase家族分子中研究较多的是Rac1，它可通过活化Pak或Rock而激活下游LIMK，促进肿瘤细胞侵袭和转移［9－10］。例如，表皮生长因子受体 HER2可通过激活 Rac1／Pak1通路促进乳腺癌细胞迁移侵袭［11］；而下调Rac1／Pak1通路能抑制内皮细胞的迁移能力［12］。

LIM激酶（lim kinase，LIMKs）是一类直接调控ADF（Destrin）／cofilins功能的分子。LIMK家族包括LIMK1和LIMK2，其中LIMK1主要与肿瘤的侵袭和转移有关［13］。LIMK1表达或活性增强可导致磷酸化ADF／cofilins水平升高，从而增加肌动蛋白聚合，促进细胞伪足形成，驱动肿瘤细胞迁移和侵袭［9］。干扰LIMK1表达可抑制cofilin1磷酸化及肿瘤细胞的迁移和侵袭［14］。我们先前报道，LIMK1在胃癌组织中高表达与临床分期和淋巴结转移相关［15］，而DADS抑制胃癌细胞迁移侵袭与其下调LIMK1有关［8］。最近的研究发现［16］，Rac1、Pak1和 Rock1在胃癌组织中表达明显高于正常组织与非典型增生组织，并且三者的表达与淋巴结转移和TNM分期呈正相关，表明Rac1、Pak1和Rock1高表达与胃癌发生、临床进展及转移有关。

Fig 4 Effects of DADSon cofilin1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

Fig 5 Effects of DADS on destrin mRNA and protein levels in MGC803 cells

为了阐明DADS抗人胃癌细胞迁移侵袭作用是否还与其干预LIMK1上游信号分子有关，我们进一步研究DADS对LIMK1上游的信号分子表达的影响。本研究结果显示，DADS可下调Rac1、Pak1和Rock1的 mRNA和蛋白水平，表明 DADS能抑制Rac1、Pak1和Rock1基因转录和蛋白表达。同时我们发现DADS对LIMK1下游分子cofilin1和destrin的表达没有影响，但DADS可下调磷酸化cofilin1水平。我们在结肠癌的研究中发现，DADS可下调Rac1、Pak1、Rock1和 LIMK1的表达，降低 destrin表达和cofilin1的磷酸化，并且DADS下调Rac1-Pak1／Rock1-LIMK1通路的作用与其抑制结肠癌细胞迁移和侵袭有关［17］。因此，结合之前发现DADS可下调LIMK1表达的结果［8］，我们分析DADS可能通过抑制Rac1-Pak1／Rock1-LIMK1通路分子的表达，导致cofilin1磷酸化减少，这一作用可能与DADS抑制胃癌细胞迁移侵袭能力有关。

综上所述，DADS不仅可下调LIMK1，而且还可通过其上游Rac1-Pak1／Rock1通路分子的表达，抑制cofilin1的磷酸化，从而抑制人胃癌细胞迁移与侵袭，表明DADS抑制人胃癌细胞迁移侵袭作用的分子机制与阻断Rac1-Pak1／Rock1通路密切相关。

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