不同提取方法对印度紫檀叶片挥发性成分的GC-MS分析

郑丽霞，高泽正，2，吴伟坚* ，梁广文，符悦冠

1华南农业大学资源环境学院，广州510642;2中国科学院华南植物园，广州510520;3中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，儋州571737

印度紫檀(Pterocarpus indicus)属蝶形花科紫檀属，俗称紫檀、蔷薇木、赤檀、青龙木、红木。原产印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾等国［1］，我国广东、广西、海南及云南均有引种栽培，主要种植于植物园、树木园和四旁绿化［2］。印度紫檀作为热带、亚热带地区的珍贵用材树种之一，不仅具有重要的经济利用及观赏价值，而且具有速生、土壤改良等特点［3］。2006年，在海南发现一种新入侵害虫——螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus)，其对印度紫檀等造成严重危害［4］。

植物挥发性次生物质对昆虫的行为有着重要的影响。植物挥发性次生物质是一些分子量在100～200的有机化学物质，包括烃类、醇类、醛类、酮类、有机酸、内酯、含氮化合物以及有机硫等化合物［5］。常用的植物挥发物的分离提取方法主要有同时蒸馏萃取法(simultaneous distillation extraction，SDE)、固相微萃取法(solid phase micro-extraction，SPME)、动态顶空吸附法(dynamic headspace adsorption，DHA)和超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)等［6］，以上方法都各具特点。国外已有研究报道了印度紫檀树皮和心材的挥发物化学成分［7］。印度紫檀叶片挥发物的化学成分还未见报道。选择合适的挥发性成分分离提取方法，对于研究印度紫檀叶片的挥发性成分有重要意义。本文作者使用SDE、SPME和DHA三种方法提取印度紫檀叶片中的挥发性成分，使用气相色谱—质谱(GC-MS)来对印度紫檀叶片中的挥发性成分进行分析，从而建立一种快速、准确、简单的挥发性成分提取方法，以期为研究螺旋粉虱等害虫与印度紫檀的相互关系提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

从广州华南农业大学校园采集新鲜印度紫檀叶片，洗去表面灰尘杂质，晾干备用;华南农业大学昆虫生态室栽培的印度紫檀盆栽。

1．2 仪器和设备

动态顶空采集装置，定制;同时蒸馏萃取装置，定制;手动SPME进样器，100μm PDMS-GC/MS萃取头，美国Supelco公司生产;RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产;GCMS-QP2010联用仪，日本岛津公司生产。

1．3 实验方法

1．3．1 同时蒸馏萃取

将印度紫檀叶片洗净切碎称取25 g置于1 L圆底烧瓶中，加入蒸馏水500 mL，连接于同时蒸馏萃取装置一端，用电热套加热，电热套的电压保持在100 V左右保持沸腾;装置的另一端连接装有150 mL无水乙醚的500mL圆底烧瓶，在50℃下水浴加热，连续萃取3 h。以无水硫酸钠脱水，过滤，滤液用旋转蒸发仪除去乙醚，得到的浅黄色油状物即是印度紫檀挥发油。

1．3．2 固相微萃取

将印度紫檀叶片洗净切碎称取25 g置于1 L的样品瓶中，用聚氟乙烯隔垫密封，备用。将SPME的萃取纤维头在气相色谱的进样口活化30 min，活化温度为250℃，活化后将固相微萃取的针管插入样品瓶内，推出萃取头，顶空萃取30 min，缩回纤维头，将针管推出样品瓶。将SPME针管插入GC/MS进样口，250℃热脱附样品进色谱柱。

1．3．3 动态顶空吸附

采样用大气采样仪(QCD-1500型，中国盐城银河科技有限公司生产)，Tenax-TA吸附管(15 cm ×0．6 cm)和 GDX-101 过滤管(15 cm × 0．6 cm)，采集的印度紫檀样枝和韧皮部组织用Tedlar(30 cm×26 cm)采样袋装裹。其基本组成如下:大气采样仪(流量计(活性炭柱空气过滤装置(GDX-101过滤管(采样袋(Tenax-TA吸附管(流量计(大气采样仪。大气采样仪出气口和进气口流量分别为250 mL/min和200 mL/min，连续吸附8 h后取下吸附管，正己烷2 mL进行洗脱，用氮气吹进行浓缩至约1 mL，每一吸附管洗脱及浓缩时间为2 min。

1．3．4 GC-MS 分析条件

使用气相色谱-质谱联用仪为岛津 GCMSQP2010，DB-5MS型气相色谱柱(30 m ×0．25 mm，0．25μm)，色谱条件:进样量为1μL，分流比为10∶1，进样口、接口温度分别为250℃和280℃;柱升温程序:起始温度60℃，保持2 min，以10℃/min速度升温至250℃，保持10 min，载气为高纯氦气，流量1．0 mL/min。质谱条件:EI离子源200℃，电子能量70 eV，扫描质量范围40～450 amu。

1．4 化合物的初步鉴定

定性分析采用计算机谱库(美国NIST 2005)进行初步检索及匹配分析，并结合文献进行人工谱图解析，确定挥发性化合物的各个化学成分。采用面积归一法计算已确定的印度紫檀挥发性化合物的相对含量。

2 结果与分析

2．1 三种方法提取挥发性成分的检出结果

图1为SDE、SPME和DHA三种方法所得印度紫檀挥发物的总离子流图，从图1和表1可知，三种方法检出并鉴定出印度紫檀的挥发性成分共70种，包括烃类、醇类、醛类、酮类、酚类、酯类、醚类、缩醛及其它种类的化合物等。其中SDE法检出25种，SPME法检出27种，DHA法检出27种;SDE法和DHA法检出的化合物出峰时间较靠前，在前20 min内，SDE法检出22种化合物，DHA法检出20种化合物，而SPME法则只检出10种化合物。三种方法检出的物质只有2种相同，即叶醇和乙酸叶醇酯;SDE法和DHA法检出的相同物质有6种;SPME法和DHA法检出的相同物质只有(Z)-丁酸-3-己烯酯和乙酸叶醇酯;19种物质仅由SDE法检出，24种物 质仅由SPME法检出，20种物质仅由DHA法检出。

图1 SDE(a)、SPME(b)及DHA(c)所得印度紫檀挥发性物质的GC-MS总离子流图Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of volatile components of P．indicus extracted by SDE，SPME and DHA

2．2 挥发性成分的比较

印度紫檀通过SDE、SPME和DHA三种方法分析之后，所检出的挥发性成分差异比较明显。GCMS鉴定出的印度紫檀挥发性成分及其相对含量见表1。SDE法检出烃类2种、醇类6种、酮类1种、酯类5种、醚类3种、缩醛8种，其中醇类和缩醛的相对含量分别为47．44%和31．57%，主要是2-硝基乙醇 (35．29%)、叶 醇 (4．23%)、2，3-丁 二 醇(3.16%)、1-辛烯-3-醇(0．88%)、4-甲基-1，3-二氧基杂环戊烷(11．18%)、2，4，5-三甲基-1，3-二氧杂环 戊 烷 (5．57%)、2-甲 氧 基-1，3-二 氧 戊 烷(4.41%)、甘油缩甲醛(3.57%)、1，1-二氧基乙烷(3.49%)等;SPME法检出的烃类5种、醇类4种、酮类4种、酚类1种、酯类9种、醚类1种、其它化合物3种。其主要检出的是酯类(62.77%)和烃类(15.67%)，其中乙酸叶醇酯和己酸叶醇酯的相对含量分别为33.62%和25.36%，剩余7种酯的相对含量之和为3.79%，检出的烃类主要是紫苏烯(5.99%)和石竹烯(7.89%);DHA法检出的醇类8种、醛类2种、酮类4种、酚类1种、酯类4种、醚类3种、缩醛3种及其它化合物2种，醇类、醚类和缩醛所占相对含量分别为47.92%、18.05%和10.87%，主要是 2-己醇(0.82%)、2-硝基乙醇(30.42%)、2-异丙氧基乙醇(3.51%)、叶醇(10.65%)、2，4-二甲基-3-戊醇(1.49%)、2-乙氧基丁烷(5.44%)、2-乙氧基-3-氯丁烷(4.58%)、2-乙氧基戊烷(8.03%)、2-乙基-1，3-二氧戊烷(1.78%)、二乙醇缩乙醛(7.84%)和 2，4，5-三甲基-1，3-二氧杂环戊烷(1.25%)。三种方法检出的结果差异较大，共同检出的化合物只有叶醇和乙酸叶醇酯。SDE法和DHA法所检出的主要是分子量较小的醇类、醚类和缩醛等，所检出的相同物质也相对较多，这两种方法都检出了含量较高的2-硝基乙醇，相对含量分别达到了35.29%和30.42%;而SPME法所检出的主要是分子量相对较大的酯类和烃类物质，这与萃取头的选择关系很大，不同种类涂层的萃取头有着不同的性能，对不同挥发物的萃取效果影响很大。

3 讨论

昆虫在寻找寄主植物的过程中，寄主植物的气味传递着有关取食、产卵及其它活动的可行性信息，对昆虫的行为反应起着关键的作用［8］。三种方法都检出了叶醇和乙酸叶醇酯，其中叶醇和反-2-己烯-1-醇、1-己醇结合棉铃象甲聚集信息素使用，能够显著提高棉铃象甲的田间诱捕量［9］。蚜虫的天敌食蚜蝇、瓢虫和草蛉等，能够利用绿叶植物气味找到蚜虫进行捕食［10，11］。本研究采用 SDE、SPME 和 DHA三种方法，提取分析了螺旋粉虱的寄主植物印度紫檀挥发物的主要化学成分。三种方法提取印度紫檀叶片挥发物的化学组成相差较大，SDE法和DHA法检出的主要是分子量较小的醇类和缩醛等，而SPME法所检出的主要是分子量相对较大的酯类和烃类物质，其重复性和重复效果不佳。所以将SDE法和DHA法这两种方法结合起来，能更好更全面地得到一些分子量较小的植物挥发性次生物如一些6个碳的醇类、烃类和酯类等，这些6个碳的绿叶植物气味在植食性昆虫寻找寄主时起着重要的作用，同时也为进一步探究螺旋粉虱等植食性昆虫危害寄主植物的化学机制提供理论依据。

表1 SDE、SPME和DHA提取的印度紫檀挥发性成分分析结果Table 1 Analysis result of volatile components of P.indicus extracted by SDE，SPME and DHA

33 植酮Hexahydrofarnesyl acetone C18 H36O－ － － － － －39.342 0.61 95酚类(2种)Phenols(two)34 乙烯基苯酚Ethenyloxybenzene C8H8 O － － － － － － 20.384 2.29 86 35 2，6-二叔丁基对甲酚Butylated hydroxytoluene C15 H24O － － － 27.615 0.69 85 － － －酯类(15种)Esters(fifteen)36 丁酸乙酯Ethyl butyrate C6H12 O2 5.215 0.04 81 － － － － － －37 丙二醇甲醚醋酸酯1-Methoxy-2-propyl acetate C6 H12 O3 5.493 4.38 87－－－－－－36 3-甲氧基乙酸丙酯3-Methoxypropyl acetate C6 H13 O3 8.770 1.30 87－－－－－－39 乙酸甲氧三甘酯Triethylene glycolmonomethyl ether acetate C9H18 O5 8.987 2.21 85－－－－－－40 乙酸叶醇酯cis-3-Hexenyl-1-acetate C8H14 O2 11.213 0.48 94 10.302 33.62 95 12.545 4.18 96 41 乙酸己酯Hexyl acetate C8 H16 O2 － － － 14.258 0.31 96 － － －42 (Z)-丁酸-3-己烯酯cis-3-Hexenyl butyrate C10 H18O2 － － － 16.770 1.79 91 25.965 0.65 94 43 丁酸己酯Hexyl butyrate C10 H20O2 － － － 16.965 0.16 74 － － －44 戊酸叶醇酯cis-3-Hexenylvalerate C11 H20O2 － － － 18.394 0.20 78 － － －45 2-(1-乙氧基乙氧基)丙酸乙酯Ethyl 2-(1-ethoxyethoxy)propancate C9 H18 O4－ － － － － －18.771 2.05 86 46 己酸叶醇酯cis-3-Hexenyl hexanoate C12 H22O2 － － － 23.434 25.36 84 － － －47 甲酸环己酯Cyclohexyl formate C7 H12 O2 － － － 24.962 0.49 80 － － －48 异丁烯酸环己酯Gyclohexylmethacrylate C10 H16 O2 － － － － － － 26.124 0.56 82 49 苯甲酸叶醇酯cis-3-Hexenyl benzoate C13 H16O2 － － － 29.337 0.46 87 － － －50 亚硫酸，丁基十三烷基酯Sulfurous acid，butyl tridecyl ester C17 H36 O3 S－ － － 31.530 0.38 88 － － －醚类(5种)Ethers(five)51 2-乙氧基丁烷2-Ethoxybutane C6 H14O 5.364 2.51 92 － － － 5.648 5.44 91 52 2-乙氧基丙烷2-Ethoxypropane C5 H12O 5.798 2.08 85 － － － － － －53 2-乙氧基-3-氯丁烷2-Ethoxy-3-chlorlbutane C6 H13 ClO － － － － － － 6.079 4.58 92 54 2-乙氧基戊烷2-Ethoxypentane C7 H16O 8.484 0.98 88 － － － 7.504 8.03 88 55 1-丁氧基戊烷1-Butoxypentane C9 H20O － － － 17.250 0.18 79 － － －缩醛类(10种)Acetals(ten)56 1，1-二氧基乙烷1，1-Diethoxyethane C6 H14 O2 3.713 3.49 93 － － － － － －57 1-乙氧基-1-丙氧基乙烷1-Ethoxy-1-propoxyethane C7H16 O2 9.219 0.93 88 － － － － － －58 2-甲氧基甲基-2，4，5-三甲基-1，3-二氧戊烷2(Methoxymethyl)-2，4，5-trimethyl-1，3-dioxolane C8 H16 O3 10.923 1.13 87 － － － － － －59 2-乙基-2，4，5-三甲基-1，3-二氧戊烷2-Ethyl-2，4，5-trimethyl-1，3-dioxolane C8 H16 O2 12.426 1.26 85 － － － － － －60 2-乙基-1，3-二氧戊烷2-Ethyl-1，3-dioxolane C5H10 O2 － － － － － － 18.419 1.78 84 61 二乙醇缩乙醛1，1-Diethoxyethane C6 H14 O2 － － － － － － 7.873 7.84 88 62 甘油缩甲醛1，3-Dioxan-5-ol C4 H8 O3 11.104 3.57 86 － － － － － －63 2，4，5-三甲基-1，3-二氧杂环戊烷2，4，5-Trimethyl-1，3-dioxolane C6H12 O2 3.667 5.57 96 － － － 4.303 1.25 95 64 4-甲基-1，3-二氧基杂环戊烷4-Methyl-1，3-dioxane C5H10 O2 4.151 11.18 86 － － － － － －65 2-甲氧基-1，3-二氧戊烷2-Methoxy-1，3-dioxolane C4 H8 O3 11.530 4.41 87 － － － － － －其它(5种)Others(five)66 苯乙氰Benzyl cyanide C8 H7 N － － － － － － 17.440 3.64 96 67 十甲基环五硅氧烷Decamethylcyclopentasiloxane C10H30 O5 Si5－ － －15.735 4.67 93 － － －

注:“－”表示未检测到。Note:“－”indicates not detected．

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