双波长薄层扫描法测定不同来源枸杞子中甜菜碱的含量

谭 亮，冀 恬，曹静亚，胡风祖

中国科学院西北高原生物研究所，西宁810008

枸杞子(Fructus Lycii)为茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L．)的干燥成熟果实。夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干，除去果梗。或晾至皮皱后，晒干，除去果梗［1］。现代药理学研究表明，枸杞子有抗衰老、降血糖、降血脂、内分泌激素调节等多方面药理作用［2-4］。近年来，有关枸杞子中多糖、甜菜碱、总黄酮、原花青素、β-胡萝卜素、东莨菪内酯等成分的含量测定屡有文献报道［5-8］。其中，甜菜碱是枸杞果、叶、柄中主要生物碱之一，在体内起甲基供体作用，是枸杞中对脂质代谢或抗脂肪肝作用的主要活性物质［9］。目前甜菜碱的检测方法主要有薄层扫描法［1］、高效液相色谱法［10］、比色法［11］等。《中国药典》2010年版一部中，规定枸杞子中甜菜碱的含量测定采用薄层扫描法。但按药典方法操作并不能得到满意的结果，于是我们以药典方法为基础，对其中部分操作做出了改进，建立了TLCS法测定枸杞子中甜菜碱的含量，并对枸杞子主产地以及周边省20批枸杞子进行测定。结果表明该方法简单、准确、重现性好，可为枸杞子质量控制提供了一定参考，为枸杞资源的研究与开发利用提供了科学理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料、试剂与仪器

枸杞子:自不同产地收集20批枸杞子，经中国科学院西北高原生物研究所分析测试中心胡风祖教授鉴定确认为正品。样品预处理:将收集的枸杞子阴干，装入密封袋中密封，置干燥器中保存。

甜菜碱对照品(批号:894-200202，中国药品生物制品检定所);甲醇、丙酮、无水乙醇、甲酸(天津市百世化工有限公司);盐酸(甘肃白银瑞斯物资贸易有限公司);雷氏盐、碘化铋钾(天津市光复精细化工研究所);活性炭(常州碧海环保技术有限公司)，以上化学试剂均为分析纯。水为一级超纯水。

CS-9000薄层扫描仪(日本岛津公司);ASE 350快速溶剂萃取仪(赛默飞世尔科技戴安公司);PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司);AG 135电子天平(METTLER TOLEDO);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);G1号垂熔砂芯漏斗(上海闳达玻璃仪器有限公司);薄层层析硅胶G板(青岛海洋化工厂分厂);CN61M/290181毛细管(北京中西远大科技有限公司第一分公司);101-3型烘箱(北京科伟仪器有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 对照品溶液的制备

取甜菜碱对照品适量，精密称定，加盐酸甲醇溶液(0．5→100)制成每1 mL含4 mg的溶液，作为对照品溶液。

1．2．2 供试品溶液的制备

使用美国戴安公司ASE 350快速溶剂萃取仪来提取枸杞子中的甜菜碱。取本品剪碎，取约2 g，精密称定，与硅藻土拌匀后填装入仪器配备的34 mL不锈钢萃取池中。在80°C条件下用80%甲醇水溶液静置提取15 min，循环提取1次。将提取液浓缩至10 mL，用盐酸调节pH值至1，加入活性炭l g，加热煮沸，放冷，滤过，用水15mL分次洗涤，合并洗液与滤液，加入新配制的2．5%雷氏盐溶液20 mL，搅匀，10°C以下放置3 h。用G1垂熔漏斗滤过，沉淀用少量冰水洗涤，抽干，残渣加丙酮溶解，转移至5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1．2．3 薄层层析与扫描条件

照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μL，分别交叉点于同一硅胶G 薄层板上，以丙酮-无水乙醇-甲酸(10∶6∶3)为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，挥干溶剂，立即喷以新配制的改良碘化铋钾试液，置105°C烘箱中加热20 min至斑点清晰。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)进行扫描，在350 nm ～700 nm范围内作全波长扫描，确定检测波长λS=530 nm，参比波长λR=625 nm，测量供试品与对照品的吸光度积分值进行计算。按上述条件所得结果见图1。

图1 枸杞子的薄层色谱图Fig.1 Thin-layer chromatogram of F．Lycii

1．2．4 线性关系的考察

精密吸取对照品溶液(3．84 mg/mL)1、2、4、6、8、10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，显色，测定其峰面积值，结果依次为 1196．15、2389．30、4864．59、7084．89、9479．18、12215．48。以峰面积为纵坐标，点样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y=314．76 X-49．90(r=0．9995)。结果表明甜菜碱点样量在3．84 ～38．40μg范围内线性关系良好。

1．2．5 重复性试验

取同一枸杞子药材(红果枸杞，青海德令哈)6份，精密称定，分别按“1．2．2”项下方法制备供试品溶液。点样5μL，展开，显色至斑点清晰，测定其峰面积值。结果甜菜碱平均含量为0．48%，RSD为2.64%。结果表明该测定方法重复性良好。

1．2．6 精密度试验

1．2．6．1 同板精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(红果枸杞，青海德令哈)5μL，在同一硅胶G薄层板上分别点样6次，展开，显色至斑点清晰，测定其峰面积值。测得峰面积值的平均值为3009．75，RSD为1．89%。结果表明该测定方法同板精密度良好。

1．2．6．2 异板精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(红果枸杞，青海德令哈)5μL，在不同的6块硅胶G薄层板上分别点样，展开，显色至斑点清晰，测定其峰面积值。测得样品中甜菜碱平均含量为0．50%，RSD为3．55%。结果表明该测定方法异板精密度良好。

1．2．7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(红果枸杞，青海德令哈)5μL，点样，展开，显色至斑点清晰，每隔30 min测定其峰面积值1次，共测定7次。测得峰面积值的平均值为3027．34，RSD为2．78%。结果表明供试品溶液在3 h内稳定性良好。

1．2．8 加样回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的枸杞子样品(红果枸杞，青海德令哈，含量为0．48%)粉末6份，每份1．0 g，精密称定，按低、中、高浓度分别精密加入甜菜碱对照品溶液。按“1．2．2”项下方法制备供试品溶液。按含量测定方法计算甜菜碱的回收率。测定平均回收率为98．3%，RSD为2．55%(n=9)。

1．2．9 样品的含量测定

分别称取所收集的不同来源的枸杞子适量，精密称定，按“1．2．2”项下方法制备供试品溶液，照薄层色谱法(附录Ⅵ B)进行试验。结果见表1～3。

表1 不同产地红果枸杞子样品中甜菜碱的含量测定结果(n=3)Table 1 Determination results of betaine contents in F．Lycii samples from different origins(n=3)

表2 同产地枸杞子不同种样品中甜菜碱的含量测定结果(n=3)Table 2 Determination results of betaine contents of different species from the same origin(n=3)

表3 同产地枸杞子不同野生和栽培样品中甜菜碱的含量测定结果(n=3)Table 3 Determination results of betaine contents of differentwild and cultivation samples from the same origin(n=3)

2 结果与分析

2．1 样品的前处理和提取

2．1．1 在线净化过程

ASE是多组分高效萃取技术，在萃取过程中一些干扰物质有时会被一起萃取出来，这些共萃取物可能会干扰样品的分析。在供试品制备中若直接加80%甲醇水溶液提取，经点样，展开，显色后发现:斑点很多，尤其是有些斑点与甜菜碱斑点出现在同一位置，无法分离，势必对分析造成一定的干扰。故在用80%甲醇水溶液提取前先加二氯甲烷，以除去大部分的脂溶性成分，减免干扰斑点的出现，使甜菜碱与杂质斑点分离。

2．1．2 ASE 提取条件的选择

(1)提取溶剂:考察了乙醇、70%，80%，90%甲醇水溶液;(2)提取温度:考察了60、70、80、90 °C;(3)提取静置时间:考察了10、15、20、30 min;(4)提取循环次数:考察了1、2、3、4次。结果表明在80°C下用80%甲醇水溶液静置提取15 min，循环提取1次时提取效率最高。

2．2 薄层层析与扫描条件的改进

在实际操作过程中发现完全按药典方法操作测定甜菜碱并不能得到满意的结果，于是以药典方法为基础，对其中部分操作做出了改进:(1)药典法采用加热回流1 h，中间有多次的转移、洗涤等操作，势必造成提取成分的损失，回收率不高。本研究使用美国戴安公司ASE 350快速溶剂萃取仪来提取枸杞子中的甜菜碱，减少了提取过程中的损失，而且该技术是在高压(1000 psi)条件下进行，大大提高了提取效率;(2)药典中所用展开剂为丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)，但在展开过程中发现展开效果并不佳，前沿不平，呈锯齿状分裂。本研究采用展开剂丙酮-无水乙醇-甲酸(10∶6∶3)，结果展开效果明显有所改善，且Rf=0．47;(3)药典中显色后需放置1～3 h至斑点清晰，而在实际操作中发现无论放置多长时间，显色斑点都不是很清晰，并且本人认为显色时间过长。本研究在显色后置105°C烘箱中加热20 min至斑点清晰，极大地缩短了显色时间且显色效果不错;(4)药典中薄层扫描条件是检测波长λS=515 nm，参比波长λR=590 nm。实际操作中在350 nm～700 nm范围内作全波长扫描发现最佳检测波长λS=530 nm，参比波长λR=625 nm，故选用后者作为薄层扫描条件。

2．3 实验测定结果分析

(1)不同产地红果枸杞子中甜菜碱含量依次为宁夏 ＞青海 ＞甘肃 ＞内蒙古 ＞新疆，但也有部分青海样品中甜菜碱含量低于甘肃样品;(2)同产地枸杞子不同种之间甜菜碱含量依次为红果枸杞＞黑果枸杞 ＞黄果枸杞;(3)同产地枸杞子不同野生和栽培样品中甜菜碱含量野生 ＞栽培。

3 结论

本研究对枸杞子样品提取、脱色时间等前处理条件进行了优化，并以药典方法为基础，对其中部分操作做出了改进，建立了枸杞子主产地以及周边省20批不同来源枸杞子中甜菜碱含量的双波长薄层扫描法。结果使用二氯甲烷除去脂溶性成分，使用ASE 350在80°C下用80%甲醇水溶液静置提取15 min，循环提取1次提取出甜菜碱。以丙酮-无水乙醇-甲酸(10∶6∶3)为展开剂，显色后置105 °C 烘箱中加热20 min至斑点清晰，在检测波长λS=530 nm，参比波长λR=625 nm条件下进行薄层扫描。该方法简便、准确，重现性好，适用于测定枸杞子中甜菜碱的含量测定。

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