甘草黄酮对2型糖尿病大鼠肝脏中GSK-3β蛋白表达的影响

金 鑫，赵海燕，马永平

北方民族大学生物科学与工程学院，银川750021

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶的两种异构体GSK-3α和GSK-3β均在人类的外周胰岛素敏感组织中表达。在静息细胞中，GSK-3是有活性的，可使糖原合成酶(Glycogen synthase，GS)的丝氨酸位点磷酸化，从而抑制GS的活性，减少糖原合成;而胰岛素可间接抑制GSK-3的活性，使GS去磷酸化，从而激活 GS，促进糖原合成。研究表明，GSK-3的活性增强或异常高表达可导致啮齿动物和人类的胰岛素抵抗［1，2］。在啮齿动物肥胖和2型糖尿病(T2DM)模型中，GSK-3抑制剂通过增加糖原合成、抑制肝脏糖异生而减少葡萄糖输出，从而增强胰岛素敏感性并改善血糖水平［3］。因此，GSK-3被认为是治疗2型糖尿病新的药物靶点。

已有研究表明，甘草黄酮(LF)可抑制KK-Ay小鼠的血糖升高和腹部脂肪积累;它对高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠的腹部脂肪积累和体重增加有明显的抑制作用，同时可降低血清胰岛素和瘦素的含量;LF还可显著降低高胆固醇患者的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)，并减少LDL-C的氧化。本实验室前期研究成果显示，LF能有效预防大鼠实验性糖尿病的发生，并可降低糖尿病大鼠的血糖、抑制其脂代谢紊乱、改善胰岛素抵抗［4］;本研究采用 Western blotting方法检测LF对2型糖尿病大鼠肝脏中GSK3β表达量的影响，旨在探索LF改善胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物与饲料

清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(40只)由宁夏医科大学实验动物中心［合格证号:SCXK(宁)2011-0001］提供，体重180～220 g。饲养于通风良好，相对湿度为50% ～70%，室温18～22℃环境中，自由进食饮水，12 h光照周期。普通饲料(标粉25%，玉米粉30%，豆粉10%，麸皮20%，鱼粉10%，酵母粉2%，食盐1%，鱼肝油1%，维生素添加剂0．5%，微量元素添加剂0．5%)与高脂高糖饲料(普通饲料61%，猪油10%，蔗糖20%，蛋黄粉8%，胆酸钠1%)均由北京科澳协力饲料有限公司提供。

1．2 试剂

甘草黄酮系以乙醇为提取剂从甘草(Glycyrrhiza uralensis Fischer)根中提取，并经柱层析进行纯化;盐酸吡格列酮片购自杭州中美华东制药有限公司;链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;碘［125I］胰岛素(INS)放射免疫分析试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司;全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;BCA protein assay kit购自Thermo Scientific公司;兔抗大鼠GSK-3β抗体、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购自Cell Signaling Technology公司。其它试剂均为分析纯。

1．3 主要仪器

ONE TOUCH血糖仪由强生(中国)医疗器材有限公司生产;DU-800核酸蛋白检测仪由Bec km an公司生产;Calibrated Densitometer(GS-800)由Bio-Rad公司生产。

1．4 动物分组与处理

采用高脂高糖饲料喂养结合一次性小剂量腹腔注射STZ的方法建立2型糖尿病(T2DM)实验大鼠模型［5］。选30只实验大鼠以高脂高糖饲料喂养6周，空腹12 h，以35 mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%STZ(溶解于0．1 mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 4．2)。72 h后尾静脉采血检测大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，稳定在 16．7 mmol/L以上为造模成功。将成模大鼠(27只)随机分为糖尿病模型组(DM，9只)、甘草黄酮组(LF，9只)和阳性对照组(PC，9只)，继续以高脂高糖饲料喂养，同时每天分别以溶剂(1，2-丙二醇)、甘草黄酮［300 mg/(kg·d)］和吡格列酮［10 mg/(kg·d)］灌胃。每周称一次体重，根据体重变化及时调整给药量［给药量(mg)=体重(kg)×甘草黄酮或吡格列酮给药剂量］，持续6周(灌胃过程中LF组和PC组各有1只大鼠死亡)。另选同批大鼠10只作为正常对照组(CON)，以普通饲料喂养，并以溶剂灌胃。

1．5 取样

实验大鼠于处死前空腹12 h，禁食不禁水，10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后迅速将其胸腔打开，心脏取血并分离血清。取部分肝脏用锡箔纸包裹后置于液氮中速冻，-80℃冰箱保存，备用。

1．6 空腹血糖和胰岛素检测

实验大鼠于处死前空腹12 h，禁食不禁水，尾静脉采血，检测各组大鼠FBG。放射免疫法测定空腹血清胰岛素(FINS)含量，具体操作按试剂盒说明进行。根据FBG和FINS的测定结果，计算ISI。

ISI=Ln(FBG×FINS)-1

1．7 免疫印迹法(Western-blotting)分析

1．7．1 肝脏总蛋白提取与定量

采用全蛋白提取试剂盒提取肝脏总蛋白，BCA protein assay kit制作蛋白标准曲线，在562 nm下用DU-800测定各样品吸光值，计算各样品的蛋白含量。

1．7．2 Western-blotting

精确量取相当于30μg蛋白质的样品液，与2×上样缓冲液等体积混合，100℃变性处理3～5 min;SDS-PAGE(7．5%分离胶和5%浓缩胶)分离蛋白质。分离的蛋白质电转移至PVDF膜。根据预染标准蛋白分子量的位置，将目的蛋白分子量范围的膜切下，以3%BSA室温封闭1．5 h。每条膜分别以封闭液配制的兔抗大鼠GSK-3β抗体或GAPDH抗体4℃孵育过夜。PBS-Tween-20洗膜3次，每次10min。加入封闭液配制的二抗(辣根过氧化物酶标记的)，室温孵育1 h。采用ECL试剂盒显色并用X射线胶片感光。

1．7．3 图像扫描及分析

采用Calibrated Densitometer(Bio-RAD，GS800)对胶片进行扫描，用Quality One软件对目的蛋白条带进行定量。蛋白相对表达量用(靶蛋白/GAPDH/Standard)的OD值表示。注:1)GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的英文缩写，作为内部参照(Internal Control)。该蛋白是由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，其在各组织和细胞中的表达相对恒定，在Western Blotting实验中常用来做参照物，以校正上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性;2)Standard为内标，是某只大鼠肝脏的蛋白提取样品，每块胶板上都采用相同的内标，以校正不同胶板之间的误差。

1．8 数据分析

2 实验结果

2．1 LF对实验大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素敏感指数的影响

LF对实验大鼠血糖、胰岛素及胰岛素敏感指数的影响如表1所示。与CON组相比，DM组大鼠的FBG显著升高(P＜0．01)、ISI显著下降(P＜0.01)。与DM组相比，LF组和PC组大鼠的FBG显著降低(P ＜0．01)，ISI显著升高(P ＜0．01)。各组FINS无显著差异。

表1 LF对空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数的影响(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，FINS and ISI±s)

表1 LF对空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数的影响(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，FINS and ISI±s)

注:* 与 CON组相比，P ＜0．01;△与DM 组相比，P ＜0．01。Note:*compare with CON，P ＜0．01;△ compare with DM，P ＜0．01．

胰岛素敏感指数CON 10 4．54 ±0．55 24．22 ±5．97 －4．67 ±0．30糖尿病模型组 DM 9 22．66 ±4．25* 25．26 ±9．97 －6．22 ±0．51*甘草黄酮组 LF 8 6．17±1．56△ 20．97±8．01 －4．70±0．49△阳性对照组 PC 8 6．09±2．35△ 21．61±10．62 －4．66±0．30 ISI正常对照组组别Group例数n空腹血糖FBG(mmol/L)空腹胰岛素FINS(m IU/L)△

2．2 LF对实验大鼠肝脏组织GSK-3β蛋白表达量的影响

采用Western-blotting方法对实验大鼠肝脏组织中GSK-3β的蛋白表达量进行检测，代表性免疫印迹图如图1所示。与CON组相比，DM组大鼠肝脏组织中GSK-3β的蛋白表达量显著升高了86．67%(P＜0．01)。与DM组相比，LF组和PC组大鼠肝脏组织中 GSK-3β的蛋白表达量分别降低了44.64%(P ＜0．05)和 55．36%(P ＜0．05);LF 组与PC组的蛋白表达量没有显著差异。

图1 肝脏组织中GSK-3β蛋白的免疫印迹图谱Fig.1 Immunoblot of GSK-3βprotein in liver

图2 各实验组大鼠肝脏组织中GSK-3β蛋白表达情况±s)Fig.2 The expression of GSK-3β protein in rats’liver of different groupss)

3 讨论

本研究采用Western Blotting方法，定量分析了甘草黄酮对糖尿病大鼠肝脏组织中GSK-3β蛋白表达的影响。研究结果表明，LF可显著降低糖尿病大鼠肝脏组织中GSK-3β蛋白的表达量，这是首例关于LF影响胰岛素信号分子蛋白表达的报道。

胰岛素对葡萄糖利用的促进作用包括刺激葡萄糖向其靶细胞内的转运和增强糖原合成两个生理过程，这两个过程均是胰岛素信号转导的结果。胰岛素信号转导的任何环节出现障碍，均会导致胰岛素抵抗，进而导致T2DM的发生与发展。GSK-3β在胰岛素信号转导中起着负调节作用，其活性增强或异常高表达可导致啮齿动物和人类的胰岛素抵抗［1，2］。研究表明［6，7］，肌肉中胰岛素调节葡萄糖利用的主要环节是葡萄糖转运;而在肝脏中，葡萄糖转运不是限速步骤。GSK-3抑制剂 CHIR98023和CHIR99021可显著提高Zucker糖尿病肥胖(fa/fa)大鼠对葡萄糖的利用，主要是通过增强胰岛素刺激的肝脏组织的糖原合成，而对肌肉组织的葡萄糖转运和糖原合成无影响［8］。上述结果提示，肝脏中GSK-3的抑制是促进机体对葡萄糖的利用和改善胰岛素抵抗的主要靶点。本研究中LF显著降低了DM组大鼠肝脏组织中GSK-3β蛋白的表达量，表明LF可能通过下调GSK-3β的表达增强肝脏组织的糖原合成，从而改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。

许多用于治疗糖尿病的胰岛素增敏剂，如噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZD)类中的 troglitazone(曲格列酮)、pioglitazone(匹格列酮)和rosiglitazone(罗格列酮)都是PPAR-γ的激活剂［9］。已有研究证实，某些甘草黄酮组分具有 PPAR-γ配体结合活性［10］，提示这些组分可能是 TZD药物的结构类似物。本研究采用吡格列酮作为阳性对照，它对GSK-3β蛋白表达的下调程度与LF的作用相当，提示LF与吡格列酮对该蛋白表达的调节作用类似。

综上所述，甘草黄酮能显著降低2型糖尿病大鼠肝脏中GSK-3β的蛋白表达量，这可能是其改善胰岛素抵抗的分子机制之一。

1 Eldar-Finkelman H，Schreyer SA，Shinohara MM，et al．Increased glycogen synthase kinase-3 activity in diabetes-and obesity-prone C57BL/6Jmice．Diabetes，1999，48:1662-1666．

2 Nikoulina SE，Ciaraldi TP，Mudaliar S，et al．Potential role of glycogen synthase kinase-3 in skeletalmuscle insulin resistance of type 2 diabetes．Diabetes，2000，49:263-271．

3 Ring DB，Johnson KW，Henriksen EJ，et al．Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transportand utilization in vitro and in vivo．Diabetes，2003，52:588-595．

4 Zhao HY(赵海燕)，Wang Y(王勇)，Ma YP(马永平)，et al．Suppressive effect of licorice flavonoids on hyperglycemia and hyperlipidemia in type 2 diabetic rats．China JMod Med(中国现代医学杂志)，2010，20:2573-2578．

5 Yang Y(杨雁)，Hu SH(胡蜀红)，Zhang JH(张建华)，et al．Alzheimer-like hyperphosphorylation of Tau in brains of rats with obesity and type 2 diabetes．Prog Biochem Biophys(生物化学与生物物理进展)，2006，33:456-464．

6 Rothman DL，Shulman RG，Shulman GI．31P nuclearmagnetic resonance measurements of muscle glucose-6-phosphate:evidence for reduced insulin-dependentmuscle glucose transport or phosphorylation activity in non-insulin-dependent diabetesmellitus．JClin Invest，1992，89:1069-1075．

7 Cline GW，Petersen KF，Krssak M，et al．Impaired glucose transport as a cause of decreased insulin-stimulated muscle glycogen synthesis in type 2 diabetes．N Engl JMed，1999，341:240-246．

8 Cline GW，Johnson K，Regittnig W，et al．Effects of a novel glycogen synthase kinase-3 inhibitor on insulin-stimulated glucosemetabolism in Zucker diabetic fatty(fa/fa)rats．Diabetes，2002，51:2903-2910．

9 Kaplan F，Al-Majali K，Betteridge DJ．PPARS，insulin resistance and type 2 diabetes．J Cardiovasc Risk，2001，8:211-217．

10 Mae T，Kishida H，Nishiyama T，et al．A licorice ethanolic extract with peroxisome proliferator-activated receptor-γligand-binding activity affects diabetes in KK-Aymice，abdominal obesity in diet-induced obese C57BLmice and hypertension in spontaneously hypertensive rats．Nutrition，2003，133:3369-3377．